兩步快速純化雞產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒方法的研究及標(biāo)準(zhǔn)抗原、標(biāo)準(zhǔn)血清的制備.pdf

1、雞產(chǎn)蛋下降綜合癥（Egg Drop Syndrome-76，簡(jiǎn)稱EDS-76）是由腺病毒感染引起種雞和蛋雞產(chǎn)蛋量急劇下降，同時(shí)伴有無(wú)殼蛋、薄殼蛋、軟殼蛋、畸形蛋的一種病毒性疾病。該病是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致雞產(chǎn)蛋率下降的重要原因之一。本研究在蔗糖密度梯度離心的基礎(chǔ)上建立了一種快速純化EDSV的新方法，制備了一批EDS-76抗雞血清，以此為生物學(xué)材料，進(jìn)一步標(biāo)定EDS-76的抗原和抗血清，獲得了標(biāo)準(zhǔn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，為EDSV的診斷和防治提供了

2、有效的方法和材料。
　　1.雞產(chǎn)蛋下降綜合癥病毒純化方法的研究
　　本研究將傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心與兩步法快速純化方法進(jìn)行了比對(duì)分析。電鏡比對(duì)結(jié)果顯示:新建立的兩步法快速純化方法可以得到大量形態(tài)大小一致的球形病毒粒子，直徑70～80nm，符合腺病毒粒子的典型特征;而傳統(tǒng)純化方法得到的病毒粒子則數(shù)量稀少，殼粒邊緣有缺損，形態(tài)模糊。血凝性試驗(yàn)比對(duì)結(jié)果顯示:傳統(tǒng)方法得到的病毒HA效價(jià)為216，而新建立的兩步法快速純化方法得到的病毒

3、HA效價(jià)為219，血凝效價(jià)較高。PCR鑒定結(jié)果顯示:用引物Ⅰ、Ⅱ分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)兩種純化方法得到的病毒均可擴(kuò)增出大小為918bp及2733bp的兩條特異性條帶。綜合分析提示:新建立的兩步法純化方法比起傳統(tǒng)方法更加省時(shí)省力，且病毒純化效果更加顯著，這為后期標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備奠定了基礎(chǔ)。
　　2.雞產(chǎn)蛋下降綜合癥標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備
　　將純化的病毒抗原進(jìn)行了PCR純異性分析、Western-blot反應(yīng)譜分析、瓊擴(kuò)試驗(yàn)分析以及病

4、毒滅活條件測(cè)定。結(jié)果表明本研究純化的病毒無(wú)CAV、REV、ALV、MDV、IBV、GPV、IBDV、ILTV等外源性病毒，無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)合格，具有很高的純粹性，且該病毒與經(jīng)典AV-127種毒具有相同的Western-blot反應(yīng)譜，同時(shí)該病毒還可以用于瓊擴(kuò)試驗(yàn)診斷。用甲醛和β-丙內(nèi)酯分別滅活該純化病毒，制備標(biāo)準(zhǔn)抗原，并進(jìn)行比較，最后確定滅活條件為0.5％β-丙內(nèi)酯作用60h。
　　將純化的病毒用PBS緩沖液稀釋至效價(jià)為214

5、，按上述滅活條件對(duì)病毒進(jìn)行滅活，加入1％BSA保護(hù)劑，分裝，凍干。對(duì)抗原的質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)檢查物理性狀、均一性、穩(wěn)定性、保質(zhì)期等進(jìn)行鑒定，最后獲得了高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)抗原。
　　3.雞產(chǎn)蛋下降綜合癥標(biāo)準(zhǔn)血清的制備
　　采取自然感染的途徑對(duì)SPF雞進(jìn)行攻毒，6免之后制得效價(jià)為215的抗雞血清。在EDSV感染的CEF上進(jìn)行IFA效價(jià)檢測(cè)，血清的IFA效價(jià)達(dá)1∶1000。特異性鑒定發(fā)現(xiàn)該血清不與NDV、AIV、ALV-J、ALV-A、