減蛋綜合癥病毒結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體優(yōu)勢抗原表位分析.pdf

1、減蛋綜合癥（Egg Drop Syndrome，EDS-76）是由減蛋綜合癥病毒（EDSV）引起的一種以產(chǎn)蛋雞產(chǎn)薄殼蛋或無殼蛋，產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降為主要特征的傳染病，該病在世界范圍內(nèi)的發(fā)生和流行給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以需要一種準(zhǔn)確、簡便的診斷方法來對該病做出診斷，也需要通過分析病毒的抗原成分篩選出合適的肽段作為亞單位疫苗用于本病的免疫預(yù)防，但這種診斷試劑和亞單位疫苗的研制，必須建立在病毒蛋白抗原結(jié)構(gòu)的研究之上。本研究利用重組克隆載

2、體pMD18-T-Hexon作為截短表達(dá)片段PCR擴(kuò)增的模板，對EDSVHexon蛋白的優(yōu)勢抗原表位進(jìn)行篩選，從而對EDSV的抗原結(jié)構(gòu)有了進(jìn)一步的了解。
　　 為了分析減蛋綜合癥Hexon蛋白的優(yōu)勢抗原表位區(qū)，采用基因重疊分段表達(dá)技術(shù)，設(shè)計(jì)了6個覆蓋整個減蛋綜合癥病毒Hexon蛋白的多肽片段，這些短肽長為15～170個氨基酸，有15～20個氨基酸重疊，將這些亞克隆的基因片段插入原核表達(dá)載體pET-30a中，分別進(jìn)行融合表達(dá)，對表

3、達(dá)的6個融合蛋白進(jìn)行切膠純化，應(yīng)用EDSV陽性血清對表達(dá)的6個重組蛋白的抗原性進(jìn)行了檢測，經(jīng)過Westernblot分析表明，融合蛋白HB（153～306）、HD（443～618）和HE（598～769）能被EDSV陽性血清所識別，鑒定表明153～306、443～18和598～769為減蛋綜合癥病毒Hexon的優(yōu)勢抗原表位區(qū)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了6個覆蓋HB（153～306）的多肽片段，13個覆蓋HDE（443～769）的多肽

4、片段，這些短肽長為35～40個氨基酸，有15個氨基酸的重疊，將這些亞克隆的基因片段插入原核表達(dá)載體pET-32a中，分別進(jìn)行融合表達(dá)及切膠純化，經(jīng)Westernblot結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白HB-3（193～229）、HB-4（216～255）、HDE-3（491～530）、HDE-5（539～577）、HDE-9（633～671）和HDE-10（657～696）能被EDSV陽性血清所識別。最后，我們進(jìn)一步縮小Hexon蛋白優(yōu)勢抗原表

5、位區(qū)的氨基酸數(shù)，設(shè)計(jì)了5個覆蓋HB-3（193～229）、3個覆蓋HDE-3（491～530）、3個覆蓋HDE-5（539～577）和5個覆蓋HDE-910（633～696）的多肽片段，每一個多肽片段合成一對寡聚核酸片段，經(jīng)磷酸化退火后插入表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行融合表達(dá)及切膠純化，經(jīng)Westernblot確定減蛋綜合癥病毒Hexon蛋白優(yōu)勢抗原表位區(qū)位于204～219、227～243、491～506、550～565、633～648和