下調(diào)DC-SIGN分子對下游抗結(jié)核免疫應(yīng)答影響的實驗研究.pdf

1、目的:探討下調(diào)人樹突狀細胞特異性細胞間粘附分子-3-結(jié)合非整合素(dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintergrin,DC-SIGN)分子對下游抗結(jié)核免疫應(yīng)答的影響,進而探討DC-SIGN在宿主抗結(jié)核免疫中的作用。
　　 方法:1.ManLAM對DCs成熟及功能的影響:密度梯度離心分離人外周血單個核細胞,貼壁2h去除懸浮細胞后,用rhGM-CSF和rhIL-4刺激誘導(dǎo)分化為D

2、Cs。第六天實驗分為DCs組和ManLAM組,加ManLAM和LPS刺激。第七天收集細胞,流式細胞儀檢測DC-SIGN、HLA-DR、CD83和CD86表達水平,ELISA檢測上清液中IL-12,IL-10水平。
　　 2.下調(diào)DC-SIGN后對DCs成熟的影響:①RNAi效果檢測:分三組即DCs組、RNAi組和陰性對照組,加慢病毒載體共孵育12h后換液,繼續(xù)培養(yǎng)60h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率及熒光強度,第六天加LPS刺激。第

3、七天收集細胞,RT-PCR檢測DC-SIGN mRNA水1基金項目:國家自然科學(xué)基金(30571653):重慶市衛(wèi)生局科研項目(05-2-113)平,Western Blot檢測DC-SIGN蛋白表達水平；②DCs轉(zhuǎn)染后表面分子表達及細胞因子水平變化:分四組即DCs組、RNAi組、ManLAM組和ManLAM+RNAi組,流式細胞儀檢測:DCs表面分子表達水平,ELISA檢測IL-12,IL-10水平。
　　 3.下調(diào)DC-SI

4、GN后對下游初始T細胞活化增殖的影響:初始CD4+CD45RA+T細胞與DCs共培養(yǎng),用ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ水平。混合淋巴細胞反應(yīng)檢測各組DCs對CD4+T淋巴細胞刺激增殖能力的影響。
　　 4.下調(diào)DC-SIGN后對巨噬細胞活化吞噬殺滅結(jié)核桿菌的影響:用與DCs共培養(yǎng)后的初始CD4_+CD45RA+T細胞與培養(yǎng)9天后的巨噬細胞混合培養(yǎng),48h后檢測TNF-α水平和NO水平。透射電鏡觀察巨噬細胞吞噬結(jié)核桿菌情況,

5、裂解巨噬細胞并接種培養(yǎng),一周后計數(shù)。
　　 結(jié)果:1.外周血單核細胞誘導(dǎo)分化的DCs在培養(yǎng)的第7天出現(xiàn)典型的形態(tài)學(xué)特征。流式細胞儀檢測ManLAM組表達CD83,CD86,DC-SIGN水平低于DCs組(p<0.05)。ELISA檢測ManLAM組IL-12水平低于DCs組,IL-10水平高于DCs組(p<0.05)。
　　 2.①熒光顯微鏡下顯示各個轉(zhuǎn)染組的細胞表面出現(xiàn)綠色熒光,當感染復(fù)數(shù)(MOI)為20時,DCs感染

6、病毒的效率達85％。RT-PCR證實RNA干擾后DC-SIGN mRNA表達水平顯著低于陰性對照組和DCs組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)。Western Blot檢測干擾組:DCs內(nèi)總DC-SIGN水平顯著低于陰。性對照組和DCs組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義p<0.05)。②流式細胞儀檢測DC-SIGN陽性率在RNAi組、ManLAM組及ManLAM+RNAi組與DCs組相比顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)；各組間HLA-DR陽

7、性率相比較差異無顯著性(p>0.05)。ManLAM組CD83和CD86表達低于其余各組(p〈0.05)；其余各組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p〉0.05)。ELISA檢測顯示ManLAM組IL-10表達水平高于其他組(p〈0.05),ManLAM+RNAi組高于DCs組及RNAi組(p<0.05),其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p〉0.05)；ManLAM組IL-12表達水平低于其他各組(p〈0.05),其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p〉0.0

8、5)。
　　 3.ELISA檢測DCs與初始CD4+CD45RA+T細胞共培養(yǎng)液中IFN-γ水平顯示,ManLAM組低于其余各組(p〈0.05)；ManLAM+RNAi組IFN-γ水平低于DCs組(p〈0.05)；其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p〉0.05)。混合淋巴細胞反應(yīng)檢測顯示ManLAM組CPM值低于其余各組(p〈0.05),其余各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。
　　 4.ELISA檢測T細胞與巨噬細胞共培

9、養(yǎng)液中TNF-α水平顯示,ManLAM組TNF-α水平低于DCs組(p〈0.05),ManLAM+RNAi組TNF-α水平高于ManLAM組(p<0.05)；硝酸還原法檢測NO水平顯示,ManLAM組NO水平低于DCs組(p<0.05),ManLAM+RNAi組NO水平高于ManLAM組(p<0.05)。巨噬細胞內(nèi)活菌計數(shù)顯示,ManLAM組高于DCs組(p〈0.05).,ManLAM+RNAi組活菌量低于ManLAM組(p〈0.05)

10、。
　　 結(jié)論:
　　 1.ManLAM能干擾DCs成熟,下調(diào)DCs誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖能力和激活初始CD4+CD45RA+T細胞向Th1細胞分化能力,降低巨噬細胞活化,最終導(dǎo)致巨噬細胞殺滅結(jié)核桿菌能力降低。
　　 2.慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾能有效的抑制DCs表面DC-SIGN分子表達,DC-SIGN表達降低對DCs成熟度及DCs誘導(dǎo)的下游免疫功能無影響。
　　 3.慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾人DC-SIGN表