人胎盤微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)及DC-SIGN、DC-SIGNR的表達研究.pdf

1、胎盤無論是形態(tài)還是功能隨孕期都是不斷變化的。有足夠的證據(jù)表明，胎盤對于病毒的母嬰垂直傳播起重要作用，如HIV，HCV，HBV等。然而，迄今為止，關(guān)于病毒如何穿過胎盤及其可能的病理結(jié)果還知甚少。微血管內(nèi)皮細胞不僅被動構(gòu)成屏障，還主動參與各種生理或病理過程。已證實，內(nèi)皮細胞不僅可作為一些病毒的儲存庫還可以使一些病毒在其中復(fù)制。同時，內(nèi)皮細胞在形態(tài)、功能、表達分子及生長因子的反應(yīng)均存在異質(zhì)性。由于缺乏內(nèi)皮細胞的分離和培養(yǎng)方法，關(guān)于微血管內(nèi)皮細

2、胞的研究還很少。因此，尋找一種較為簡單的分離和培養(yǎng)人胎盤微血管內(nèi)皮細胞(HPMEC)的方法是十分必要的。 DC-SIGN(樹突狀細胞特異性細胞間黏附分子結(jié)合非整合素)及同源物DC-SIGNR均是C-型凝集素家族成員。兩者在氨基酸序列上有77％的同源性；同時均能識別病原體或自身抗原表面所包含的高甘露糖型葡聚糖及巖藻糖結(jié)構(gòu)。兩者對于病原體的結(jié)合和處理過程不同，但主要不同是在組織及細胞的表達。病毒型病原體如Ebola，HIV-2，HC

3、V，SIV-1，SIV-2和非病毒型病原體如結(jié)核桿菌，無鞭毛型利什曼原蟲等都可以與DC-SIGN，DC-SIGNR結(jié)合。兩種受體在體HPMEC均有表達。 所以，我們探索培養(yǎng)HPMEC以研究其形態(tài)、功能并構(gòu)建胎盤屏障體外極性模型。同時，鑒于DC-SIGN及DC-SIGNR能作為病原體的特殊受體及其分布和表達，我們推測其可能通過胎盤微血管內(nèi)皮細胞參與宮內(nèi)感染。主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1.通過蛋白水解酶消化得到組織和細胞的混懸液

4、，再經(jīng)過不連續(xù)的Percoll梯度離心得以純化，獲較高純度，可連續(xù)傳代的HPMVEC。具體方法是：將胎盤的末端絨毛依次用膠原酶、Dispase酶、DNA酶及胰酶消化，收集混懸液，過4層無菌紗布，再收集濾液并加到25％～30％～35％的不連續(xù)Percoll梯度離心，收集密度為1.02～1.04g/ml間(距離Percoll梯度液面1.5～2.0CM處)的白色帶。最終，獲得高純度并在含胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。HPMVEC的生長

5、曲線顯示培養(yǎng)第4-7天為增殖高峰期。 2.應(yīng)用光鏡、透射電鏡和免疫細胞化學等技術(shù)對所獲內(nèi)皮細胞進行鑒定。透射電鏡下可見內(nèi)皮細胞的特征性結(jié)構(gòu)Weibel-Palade小體及豐富的線粒體、微絲等。FⅧ-Rg免疫細胞化學染色示細胞漿及核周呈陽性反應(yīng)。CD34免疫細胞化學染色示細胞膜呈陽性反應(yīng)。形態(tài)學及免疫化學結(jié)果表明所獲HPMEC具有內(nèi)皮細胞屬性。 3.通過免疫熒光化學、Western-blot、RT-PCR，從蛋白及mRNA