高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅰ介導(dǎo)HBV去甘露糖修飾以逃逸樹(shù)突狀細(xì)胞DC-SIGN免疫識(shí)別的研究.pdf

1、目的：
　　探尋高爾基體α甘露糖苷酶Ⅰ(Golgi MⅠ)介導(dǎo)的HBV(乙型肝炎病毒)的去甘露糖修飾，是否能使病毒逃逸樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)表面DC-SIGN的免疫識(shí)別及其機(jī)制。將DC-SIGN基因沉默后，觀察DCs在野生型HBV或高甘露糖型HBV刺激下的免疫指標(biāo)，研究野生型HBV與高甘露糖型HBV對(duì)DC的成熟和免疫活化的影響，以及DC-SIGN在HBV感染中發(fā)揮的免疫作用。在課題組既往實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)尋找可能存在于HBe功能蛋白

2、基因序列中的促進(jìn)宿主細(xì)胞Golgi MⅠ活性的核心片段，來(lái)初步探討Golgi MⅠ相關(guān)的HBV去甘露糖修飾，通過(guò)何種機(jī)制逃逸DC-SIGN對(duì)HBV的免疫識(shí)別及阻礙DCs免疫活化。
　　方法：
　　一、樹(shù)突狀細(xì)胞DC-SIGN的基因沉默及其對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響
　　1.分離健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行體外培養(yǎng)，以GM-CSF、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF-α)將其誘導(dǎo)分化為DC；

3、r>　　2.構(gòu)建DC-SIGN基因沉默的siRNA序列，分組轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞；
　　3.RT-PCR法檢測(cè)DC細(xì)胞內(nèi)DC-SIGNmRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC細(xì)胞表面DC-SIGN的表達(dá)，選擇DC-SIGN沉默效果最好的序列進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；
　　4.空白對(duì)照組、DC-SIGN基因沉默組與轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)siRNA序列組的DC細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面分子CD80、CD83、CD86、CDla、HLA-DR的表達(dá)；
　　5.EL

4、ISA法檢測(cè)4中所述三組DC細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-10與IL-12p70的水平；
　　6.MTT法檢測(cè)4中所述三組DC細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力；
　　7.Westernblot法檢測(cè)4中所述三組DC細(xì)胞內(nèi)NF-кB p65與p38的表達(dá)；
　　二、野生型與高甘露糖型HBV對(duì)DC-SIGN基因非沉默與沉默的樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響
　　1.體外培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞；
　　2.加入基夫堿母液至

5、HepG2.2.15細(xì)胞中，使基夫堿終濃度為5ug/ml，如此處理5天后收集HepG2.2.15培養(yǎng)上清液；
　　3.通過(guò)低溫超速離心法，從基夫堿處理的HepG2.2.15細(xì)胞提取獲得高甘露糖型HBV顆粒，從HepG2.2.15細(xì)胞提取獲得野生型HBV，并以熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA滴度；
　　4.體外培養(yǎng)PBMC并誘導(dǎo)分化的DC分為DC-SIGN沉默與非沉默兩組，每組三個(gè)亞組：對(duì)照組、加野生型HBV組，加高甘露糖型

6、HBV組。在DC培養(yǎng)第5天將收獲HBV顆粒(調(diào)整濃度為5×106copies/ml)，加入到相應(yīng)組的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第7天時(shí)，進(jìn)行如下檢測(cè)；
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述6個(gè)亞組中DC細(xì)胞表面分子CD80、CD83、CD86、CDla、HLA-DR的表達(dá)
　　6.ELISA法檢測(cè)上述6個(gè)亞組中DC細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-10與IL-12p70的水平；
　　7.MTT法檢測(cè)上述6個(gè)亞組中DC細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力

7、；
　　8.Westernblot法檢測(cè)上述6個(gè)亞組中DC細(xì)胞NF-кB p65與p38的表達(dá)；
　　三、HBe基因片段中促進(jìn)Golgi MⅠ活性的核心序列質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　1.取出本實(shí)驗(yàn)室保存的采用分子克隆的方法構(gòu)建并鑒定過(guò)的HBe功能蛋白的真核表達(dá)載體(質(zhì)粒)，分析表達(dá)的HBe蛋白結(jié)構(gòu)域；
　　2.Wingene軟件分析酶切位點(diǎn)，將HBe質(zhì)粒的基因序列切分為三段目的序列，分別在每段序列的上下游加入酶切位點(diǎn)

8、Xho I，BamH I。設(shè)計(jì)各序列引物，PCR擴(kuò)增，將目的片段連接載體pEGFP-N1，構(gòu)建分別包含三個(gè)表達(dá)HBe亞片段的真核表達(dá)載體，依次命名為HBe-1、HBe-2、HBe-3，分別進(jìn)行測(cè)序鑒定；
　　3.將上述3種含HBe亞片段的質(zhì)粒和含HBe全長(zhǎng)的質(zhì)粒分別經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染進(jìn)入HepG2細(xì)胞內(nèi)，設(shè)置空白對(duì)照組，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞綠色熒光蛋白的表達(dá)；
　　4.RTPCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染上述各質(zhì)

9、粒后5組HepG2細(xì)胞Golgi MⅠ的2種亞型基因MAN1A1、MAN1A2的mRNA表達(dá)水平；
　　5.Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染上述各質(zhì)粒后5組HepG2細(xì)胞MAN1A1、MAN1A2的蛋白表達(dá)水平；
　　結(jié)果：
　　一、樹(shù)突狀細(xì)胞DC-SIGN的基因沉默及其對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響
　　1.成功選擇了能使DC表面DC-SIGN基因沉默的siRNA序列。
　　2.用siRNA沉默DC-SIGN

10、，對(duì)以下指標(biāo)無(wú)影響：DC表面CD1a、CD80、CD83、CD86、HLADR的表達(dá)水平、DC細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖能力、DC細(xì)胞IL-10及IL-12p70的分泌水平，以及DC細(xì)胞內(nèi)NF-кB p65與p38的表達(dá)水平。
　　二、野生型與高甘露糖型HBV對(duì)DC-SIGN基因非沉默與沉默的樹(shù)突狀細(xì)胞免疫功能的影響
　　1.DC-SIGN非基因沉默的亞組中，與高甘露糖型HBV干預(yù)的DC亞組相比，野生型HBV干預(yù)的DC亞組

11、，細(xì)胞表面分子CD80、CD83、CD86、CDla、HLA-DR的表達(dá)較低，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12p70的水平較低而IL-10的表達(dá)水平較高，細(xì)胞刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力較弱，細(xì)胞內(nèi)NF-кB p65與p38的表達(dá)水平較低；
　　2.在DC-SIGN基因沉默的三個(gè)亞組中，野生型HBV干預(yù)的DCs與高甘露糖型HBV干預(yù)DCs，上述指標(biāo)無(wú)明顯差異；
　　3.不論是否進(jìn)行DC-SIGN基因沉默，不論用野生型HBV或高甘露

12、糖型HBV干預(yù)，與未用HBV干預(yù)的DC細(xì)胞相比，以HBV干預(yù)的DC，上述各指標(biāo)表達(dá)均升高，具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；
　　三、HBe基因片段中促進(jìn)Golgi MⅠ活性的核心序列質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　1.成功構(gòu)建三種分別含有三段HBe亞片段多肽基因的真核表達(dá)載體，且成功地將此三種質(zhì)粒及含有HBe全長(zhǎng)蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞；
　　2.轉(zhuǎn)染了表達(dá)HBe全長(zhǎng)或片段多肽質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，不論轉(zhuǎn)染的是哪一種質(zhì)粒，與對(duì)照組

13、相比，HepG2細(xì)胞MAN1A1mRNA的表達(dá)量上升；且除HBe-1組外，HepG2細(xì)胞MAN1A2mRNA的表達(dá)量也上升。
　　3.轉(zhuǎn)染了表達(dá)HBe全長(zhǎng)或片段多肽質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞，不論轉(zhuǎn)染的是哪一種質(zhì)粒，與對(duì)照組相比，MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的表達(dá)量均上升；
　　4.HBe-2轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞后，其表達(dá)MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平平均值，均最接近轉(zhuǎn)染

14、HBe全長(zhǎng)質(zhì)粒組HepG2細(xì)胞的水平；其中特別地，HBe-2轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞后，其表達(dá)MAN1A2蛋白的能力與HBe全長(zhǎng)質(zhì)粒組無(wú)差異。
　　5.HBe-1、HBe-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，其表達(dá)MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平，明顯低于HBe全長(zhǎng)質(zhì)粒組的HepG2細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.siRNA對(duì)DC表面DC-SIGN進(jìn)行基因沉默后，對(duì)DC細(xì)胞的免疫功能