腹膜血管新生引起腹膜超濾衰竭的機(jī)制及其阻斷干預(yù)實(shí)驗(yàn).pdf

1、背景和目的
　　 終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)已成為21世紀(jì)全人類面臨的主要公共健康問(wèn)題之一。腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是終末期腎臟病有效的治療方法,具有保護(hù)殘余腎功能、花費(fèi)相對(duì)血液透析低等優(yōu)勢(shì)。但由于腹膜透析的并發(fā)癥,如腹膜炎、營(yíng)養(yǎng)不良、腹膜超濾衰竭,尤其透齡4-5年的患者,腹膜超濾衰竭發(fā)生率高達(dá)36％,已經(jīng)成為腹膜透析患者被迫退出腹透的主要因?yàn)橹?因

2、此探討并干預(yù)腹膜透析超濾衰竭的發(fā)生與發(fā)展非常重要。
　　 目前認(rèn)為超濾衰竭的發(fā)病機(jī)制主要有三方面的因素:1、腹膜血管表面積的不斷增加:約50％到75％的超濾衰竭是由于腹膜血管新生導(dǎo)致腹膜血管表面積的不斷增加,使得小分子溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)加快致腹腔滲透壓遞度迅速消失,使腹膜超濾功能喪失；2、因?yàn)樗ǖ赖鞍资Чδ埽?、腹膜間質(zhì)/淋巴系統(tǒng)吸收增加。
　　 腹膜血管新生可能是超濾衰竭發(fā)生的主要機(jī)制,調(diào)節(jié)血管新生的誘導(dǎo)劑有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(

3、vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,)等其它可溶性因子；抑制劑包括血管新生抑制素、內(nèi)皮細(xì)胞抑制素(endostain,ES)等。目前認(rèn)為血管生成時(shí)受到誘導(dǎo)因子和抑制因子的雙重調(diào)節(jié),正常情況下處于平衡狀態(tài),一旦誘導(dǎo)劑占優(yōu)勢(shì),則激活血管長(zhǎng)出新生血管,反之則使血管硬化。長(zhǎng)期行腹膜透析的病人在其腹膜透析液中發(fā)現(xiàn)一些血管誘導(dǎo)劑增加,

4、如VEGF、bFGF等,而且目前公認(rèn)為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腹透失超濾的發(fā)病機(jī)制中,是促進(jìn)血管新生的主要因子,在血管新生中居于主導(dǎo)地位,并發(fā)現(xiàn)它在腹膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞(peritonealmesothelial cells,PMc)有陽(yáng)性表達(dá),但這些導(dǎo)致血管新生的因子表達(dá)增加的具體機(jī)制目前仍不清楚。綜上所述我們有必要探討腹膜血管新生在腹透失超濾發(fā)生機(jī)制所起的作用并進(jìn)行干預(yù)研究,以便為延緩腹透失超濾的發(fā)生提供理論根據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù),

5、從而為多環(huán)節(jié)防治腹膜透析超濾衰竭的發(fā)生發(fā)展提供有效的治療手段。
　　 因此本研究共分三部分:
　　 第一部分腹膜血管新生引起腹膜超濾衰竭的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　 構(gòu)建5/6腎切除尿毒癥大鼠模型,進(jìn)而構(gòu)建尿毒癥腹膜透析大鼠模型。檢測(cè)大鼠腹膜組織VEGF、bFGF及ES基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化,以及檢測(cè)腹膜組織毛細(xì)血管密度(MVD),探討腹膜新生血管引起大鼠腹膜透析超濾衰竭的機(jī)制,為了下一步干預(yù)實(shí)驗(yàn)打好理論基礎(chǔ)。

6、>　　 第二部分腹膜血管新生引起腹膜超濾衰竭的臨床研究
　　 留取正常對(duì)照者(取自非尿毒癥的腹部擇期手術(shù)患者,排除任何可累及腹膜的疾病)、尿毒癥非透析患者(尿毒癥患者首次腹透置管時(shí))以及腹透超濾衰竭患者(尿毒癥患者拔出腹透管時(shí))的腹膜活檢標(biāo)本。檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮抑素基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá),檢測(cè)腹膜組織毛細(xì)血管密度。為下一步干預(yù)腹膜透析超濾衰竭的研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 第三部分重組人內(nèi)皮抑素

7、(恩度)干預(yù)腹膜血管新生的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　 應(yīng)用重組人內(nèi)皮抑素(恩度),干預(yù)大鼠腹膜透析腹膜血管新生,從而起到抑制腹膜血管新生,干預(yù)腹膜透析超濾衰竭的作用,為下一步治療臨床腹膜透析患者超濾衰竭提供實(shí)驗(yàn)根據(jù)。
　　 一.資料與方法
　　 SD雄性大鼠42只,體重180-200g。構(gòu)建5/6腎切除尿毒癥大鼠模型,進(jìn)而構(gòu)建尿毒癥腹膜透析大鼠模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)立正常組(n=8只),手術(shù)組三組:尿毒癥組(n=8只)、1.5％腹

8、膜透析組(n=8只)、4.25％腹膜透析組(n=8只)。對(duì)各透析組大鼠進(jìn)行規(guī)律腹透,每日每只20ml腹透液從大鼠頸部腹透管注入,腹腔保留2h后放出液體,規(guī)律透析28天后,取各組大鼠新鮮腹膜組織分別做逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及組織免疫組化,檢測(cè)VEGF、bFGF及ES基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化,以CD34染色檢測(cè)腹膜組織毛細(xì)血管密度(MVD),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較和基因水平的相關(guān)性分析,選取α=0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水

9、準(zhǔn)。
　　 二.結(jié)果
　　 1.VEGF、bFGF及ES在正常大鼠腹膜組織中呈陽(yáng)性表達(dá)。
　　 2.與正常組相比較,尿毒癥組、1.5％腹膜透析組、4.25％腹膜透析組,VEGF、bFGF在基因及蛋白的表達(dá)水平均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 3.正常組、尿毒癥組、1.5％腹膜透析組及4.25％腹膜透析組大鼠腹膜組織中均有ES mRNA表達(dá)。其中正常組為0.47±0.05；尿毒癥組為0.4

10、5±0.04；1.5％腹膜透析組為0.46±0.04；4.25％腹膜透析組為0.47±0.03；各組間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.正常組大鼠腹膜組織中ES蛋白表達(dá)積分0分；尿毒癥組大鼠腹膜組織中積分2分；1.5％腹膜透析組大鼠腹膜組織中積分4分；4.25％腹膜透析組大鼠腹膜組織中呈高表達(dá),積分9分。
　　 5.與正常組相比較,尿毒癥組、1.5％腹膜透析組、4.25％腹膜透析組大鼠腹膜組織中MVD的表

11、達(dá)均增高,組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 第二部分腹膜血管新生引起腹膜超濾衰竭的臨床研究
　　 一.資料與方法
　　 留取正常對(duì)照者、尿毒癥非透析患者以及腹透超濾衰竭患者的腹膜活檢標(biāo)本。將所留取的腹膜標(biāo)本分別行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和組織免疫組化染色,檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮抑素基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。行CD34染色,計(jì)數(shù)腹膜組織毛細(xì)血管密度。
　　 二.

12、結(jié)果
　　 1.VEGF、bFGF及ES的mRNA在各組人腹膜組織均有表達(dá)。與正常相比較,尿毒癥非透析組、PD組腹膜組織VEGF、bFGF mRNA表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與尿毒癥非透析組相比較,PD組腹膜組織 VEGF、bFGF mRNA表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ES mRNA各組表達(dá)無(wú)差異。
　　 2.各組腹膜組織均表達(dá)VEGF、bFGF及ES。與正常相比較,尿毒癥非透析組、

13、PD組腹膜組織VEGF、bFGF、ES蛋白表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與尿毒癥非透析組相比較,PD組腹膜組織VEGF、bFGF、ES蛋白表達(dá)上調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.MVD計(jì)數(shù)結(jié)果在正常組可見新生毛細(xì)血管較少或無(wú),與正常組相比較,尿毒癥非透析組、腹膜透析超濾衰竭組人腹膜組織MVD計(jì)數(shù)增加(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第三部分重組人內(nèi)皮抑素(恩度)干預(yù)腹膜血管新

14、生的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　 一.資料與方法
　　 清潔級(jí)雄性SD大鼠43只,體質(zhì)量為180-200g。構(gòu)建5/6腎切除尿毒癥大鼠模型,進(jìn)一步構(gòu)建尿毒癥腹膜透析大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為A:對(duì)照組(正常組:n=8只),B:尿毒癥非透析組(5/6腎切除組:n=8只)、C:尿毒癥腹膜透析組(生理鹽水對(duì)照組:n=8只)、D1:重組人內(nèi)皮抑素治療1組(10mg/kg治療組:n=8只),D2:重組人內(nèi)皮抑素治療2組(40mg/kg治療組:n=8

15、只)。對(duì)C、D1、D2組大鼠進(jìn)行規(guī)律腹透,每日4.25％的腹透液從大鼠頸部腹透管注入,腹腔保留2h后放出液體,規(guī)律透析28天。D1、D2組(重組人內(nèi)皮抑素治療1、2組)在規(guī)律腹透期間,隔天皮下注射重組人內(nèi)皮抑素,連續(xù)給藥14次,直至腹透第28天結(jié)束,留取各組大鼠新鮮腹膜組織,采用免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的方法檢測(cè)腹膜組織VEGF基因及蛋白水平的表達(dá),用CD34染色觀察各組大鼠腹膜血管數(shù)并計(jì)算腹膜組織毛細(xì)血管密度(

16、Microvessel Density,MVD),所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,選取α=0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 二.結(jié)果
　　 1.與正常組相比較,尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析組,VEGF基因及蛋白水平的表達(dá)均升高(p<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與尿毒癥腹膜透析組相比較,重組人內(nèi)皮抑素治療1組、重組人內(nèi)皮抑素治療2組,VEGF基因及蛋白水平的表達(dá)均降低(p<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與重組人內(nèi)

17、皮抑素治療1組相比較,重組人內(nèi)皮抑素治療2組,VEGF-A基因及蛋白水平的表達(dá)均降低(0<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.與正常組相比較,尿毒癥組、尿毒癥腹膜透析組,MVD的值均增加(p<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與尿毒癥腹膜透析組相比較,重組人內(nèi)皮抑素治療1組、重組人內(nèi)皮抑素治療2組,MVD的值均降低(p<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與重組人內(nèi)皮抑素治療1組相比較,重組人內(nèi)皮抑素治療2組,MVD的值降低(

18、p<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.VEGF基因水平的表達(dá)與MVD值呈現(xiàn)正相關(guān),VEGF和尿毒癥長(zhǎng)期腹透時(shí)腹膜血管新生相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1.大鼠和人的腹膜組織均表達(dá)VEGF、bFGF及ES,體內(nèi)尿毒癥環(huán)境和非生理性腹透液的刺激可以上調(diào)腹膜組織VEGF、bFGF基因和蛋白的表達(dá)。
　　 2.尿毒癥腹膜透析大鼠和人腹膜組織VEGF、bFGF基因及蛋白水平表達(dá)升高,可能在長(zhǎng)期透析所致腹膜組織

19、新生毛細(xì)血管形成過(guò)程中發(fā)揮一定的促血管新生作用,是腹透失超濾發(fā)生的重要因素之一。
　　 3.體內(nèi)尿毒癥毒素和非生理性腹透液刺激可使大鼠和人的腹膜組織ES蛋白表達(dá)升高,在長(zhǎng)期透析所致腹膜組織毛細(xì)血管生成增多中可能發(fā)揮一定的抑制血管生成作用。
　　 4.重組人內(nèi)皮抑素(恩度)能抑制尿毒癥腹膜透析大鼠腹膜新生血管的形成,并且其抑制作用的強(qiáng)弱與藥物的劑量有關(guān)。
　　 5.重組人內(nèi)皮抑素(恩度)可能是通過(guò)下調(diào)尿毒癥腹膜透析