急性腦損傷大鼠NF-κB表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察及CCK-8對(duì)其抑制作用的研究.pdf

1、目的：顱腦外傷(trauma brain injury,TBI)后繼發(fā)腦水腫是危及生命和影響病人預(yù)后的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，傷后引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)是造成腦水腫的主要原因。有研究表明炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子的大量表達(dá)與腦組織的繼發(fā)損傷程度密切相關(guān)。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Necular Factor Kappa B，NF-κB)是炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)過(guò)程中一個(gè)至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB的活化可通過(guò)激起腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis facto

2、r-α，TNF-α)和白介素-1(interleukin-1，IL-1)等促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而加重顱腦外傷后的繼發(fā)性炎性損害。膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種典型的腦腸肽，近年來(lái)許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)膽囊收縮素-8具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，并作為一種新型的抗炎因子被廣泛應(yīng)用，但目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有將其運(yùn)用于急性顱腦損傷方面的研究。為此我們通過(guò)建立穩(wěn)定的大鼠腦挫傷動(dòng)物模型，觀察NF-κB在腦損傷后腦組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并對(duì)腦損傷大

3、鼠應(yīng)用CCK-8，檢測(cè)挫傷側(cè)腦組織含水量及NF-κB的表達(dá)變化，對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法：成年雄性SD大鼠104只，體重250～300 g，隨機(jī)分為4組，采用液壓打擊致傷法制作大鼠腦外傷模型。假手術(shù)組(8只)，大鼠只行顱骨開(kāi)窗，不做液壓打擊；損傷組(48只)，按損傷后時(shí)間分為1h、6 h、12 h、24h、72 h、5d六個(gè)亞組，每亞組8只大鼠；CCK-8治療組(24只)，根據(jù)NF-κB在傷后表達(dá)最強(qiáng)的時(shí)間三個(gè)點(diǎn)12 h

4、、24h、72h，分為三個(gè)亞組，每亞組8只大鼠。于致傷前30min，按40 μg/kg，經(jīng)尾靜脈注射CCK-8，0.2ml/只；生理鹽水治療組(24只)，分為傷后12 h、24h、72h三個(gè)亞組，于致傷前30min注射等量生理鹽水，0.2ml/只，后制作大鼠腦挫傷模型。將動(dòng)物按時(shí)間點(diǎn)斷頭處死，取挫傷灶前緣2mm處腦皮質(zhì)100 μg，放于-70℃冰箱保存，采用電泳遷移率改變分析方法(electrophoretic mobilityshif

5、t assay，EMSA)檢測(cè)胞核內(nèi)NF-κB蛋白的表達(dá)，并做光密度定量分析；另取挫傷灶邊緣腦皮質(zhì)約(200±50)mg，用干濕重法測(cè)量腦含水量；剩余挫傷邊緣腦組織用4％多聚甲醛固定、脫水、包埋。將腦組織切成4 mm厚薄片，用做蘇木精。伊紅染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化，以及免疫組化方法觀察腦挫傷后不同時(shí)間大鼠腦組織表達(dá)NF-κB的情況。結(jié)果：1 腦含水量變化損傷組大鼠腦外傷后1h損傷側(cè)腦組織含水量與假手術(shù)組相比雖然有所升高，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)

6、顯著性差異，P＞0.05。從傷后6h開(kāi)始損傷側(cè)腦組織含水量較假手術(shù)組有所升高，傷后12h腦組織腦含水量明顯升高，24h腦組織含水量達(dá)到高峰為(85.70±1.41)％，高峰持續(xù)到72h，而后開(kāi)始下降。5d后明顯降低腦組織含水量為(77.29±1.57)％。CCK-8治療組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量與生理鹽水治療組比較，有明顯的降低，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.炎癥反應(yīng)情況假手術(shù)組大鼠腦組織無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。腦損傷組大鼠傷后1h

7、病變周圍未發(fā)現(xiàn)明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況，傷后6h挫傷組織周圍開(kāi)始出現(xiàn)散在的炎細(xì)胞，并可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞在血管腔內(nèi)聚集，向外遷移。傷后12 h可見(jiàn)挫傷組織缺血壞死明顯，與周圍正常組織邊界清楚，挫傷周圍出現(xiàn)深染的單核淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；傷后24h炎性細(xì)胞浸潤(rùn)繼續(xù)多以單核細(xì)胞為主，并可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞。傷后72h炎性細(xì)胞大量集聚于壞死組織及壞死組織周邊，以分葉核的中性粒細(xì)胞為主，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，在壞死區(qū)內(nèi)開(kāi)始有新生毛細(xì)血管生成。傷后5d膠質(zhì)細(xì)胞大量增生，

8、殘留壞死組織基本被吸收完全，成纖維細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞較前有所減少。CCK-8治療組各時(shí)間點(diǎn)腦組織切片經(jīng)HE染色，可見(jiàn)炎性細(xì)胞數(shù)量較損傷組及同時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組有明顯減少，神經(jīng)細(xì)胞水腫及壞死程度也有顯著減輕。 3 NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)假手術(shù)組腦組織僅有微量NF4-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。腦損傷組大鼠腦損傷后1h NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)開(kāi)始增多，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為10.00±1.52。傷后6h陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，在挫傷區(qū)及挫傷周圍腦組織均可見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞表

9、達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為17.56±2.40。12h陽(yáng)性細(xì)胞急劇增多，主要集中在挫傷組織邊緣，然后隨著時(shí)間的推移，挫傷灶周圍的陽(yáng)性細(xì)胞越來(lái)越多，至24 h達(dá)到高峰，為38.00±1.76，72h后陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)開(kāi)始減少，但仍明顯高于假手術(shù)組，到5d時(shí)明顯減少，基本趨于穩(wěn)定。腦損傷組大鼠腦組織挫傷后病變側(cè)各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值為200.967，P＜0.05.CCK-8治療組與生理鹽水治療組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)

10、數(shù)量明顯減少，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4 EMSA電泳條帶光密度值分析損傷組傷后各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織細(xì)胞核中NF-κB蛋白含量與假手術(shù)組大鼠比較均有顯著增高。而CCK-8治療組與生理鹽水治療組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，NF-κB的含量明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，這一結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致。結(jié)論：大鼠急性腦損傷后挫傷腦組織周圍NF-κB的表達(dá)與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量及腦含水量的增加在時(shí)間上具有一致性，提示NF-κ B的