GDNF促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞鈣結(jié)合蛋白表達(dá)的分子信號(hào)機(jī)制研究.pdf

1、目的:本研究旨在探討PI-3K/AKT和NF-кB信號(hào)通路是否參與了膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)通過促進(jìn)鈣結(jié)合蛋白(calbindin D28K，CB)表達(dá)而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的作用。 方法:以成年SD(Sprague-Dawley rat)大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，于其右側(cè)紋狀體注入6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-

2、OHDA)，注射7天后行為學(xué)篩選出早期帕金森病(Parkinson’s disease，PD)模型鼠。然后在此模型鼠右側(cè)黑質(zhì)致密部行立體定位注射，依據(jù)注入不同的藥物將大鼠分為五組：空白組，不注入任何藥物，但有手術(shù)過程：PBS組，在其右側(cè)黑質(zhì)致密部注入PBS(2μl，0.01mmol/L)；GDNF組，在其右側(cè)黑質(zhì)致密部注入GDNF(2 μl，20 ng/μl)；GDNF+Helenalin組，于右側(cè)黑質(zhì)致密部先注入Helenalin(2

3、 μl，0.5 μg/μl；這是NF-кB信號(hào)通路特異性阻斷劑)，30分鐘后，再注入GDNF；GDNF+Wortmannin組，于右側(cè)黑質(zhì)致密部先注入Wortmarmin(2 μl，0.5 μg/μl；這是PI-3K/AKT信號(hào)通路特異性阻斷劑)，30分鐘后，再注入GDNF。動(dòng)物存活一定時(shí)間后處死，以免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組大鼠黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中CB、p-AKT及p65(NF-кB/Rel家族成員)的表達(dá)；并用免疫印跡技術(shù)對(duì)胞

4、漿中的CB、胞漿和胞核中p65進(jìn)行定量檢測(cè)；以免疫共沉淀技術(shù)觀察模型大鼠在GDNF作用下黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的胞核中p65結(jié)合p50或p52(此三種成分為NF-кB家族成員，在NF-кB信號(hào)通路激活后，相互之間能形成二聚體)的情況。 結(jié)果: GDNF組的CB陽性淺染細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組、PBS組、GDNF+Helenalin組和GDNF+Wortmannin組；并且GDNF組的CB含量也升高，但GDNF+Helenalin

5、組和GDNF+Wortmannin組的CB含量明顯低于GDNF組。GDNF組中p-AKT陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于PBS組，同時(shí)，GDNF組中胞核含p65的量升高而胞漿p65的含量下降。而在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到：在胞核p65免疫沉淀復(fù)合物中，GDNF組的p50含量低于空白組及PBS組，而GDNF組的p52含量卻明顯高于空白組及PBS組；同樣，在胞核p52免疫沉淀復(fù)合物中，GDNF組的p65含量也明顯高于空白組及PBS組。 結(jié)論: