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文檔簡介
1、目的:乳腺癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的一種惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計,全球每年約有120萬~140萬婦女患乳腺癌,約有50萬患者死于該病。研究表明,乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多基因作用的結(jié)果。隨著乳腺癌發(fā)病率的不斷增加,對其易感基因、相關(guān)基因及其產(chǎn)物的研究已成為腫瘤學(xué)關(guān)注的熱點問題。研究發(fā)現(xiàn),作為細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子,14-3-3σ在人類乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)下降可能是乳腺癌發(fā)生的一個重要原因。研究已經(jīng)證實,p53是14-3-3σ活化的主要調(diào)控因子。p73
2、α是p73基因的剪切變異體,之前的體外實驗已經(jīng)證實,當(dāng)p53基因缺失或突變時,p73α可以替代p53調(diào)節(jié)下游基因14-3-3σ,提高其抗腫瘤作用。但是至今,關(guān)于p73α和14-3-3σ抑制乳腺癌生長的體內(nèi)實驗研究尚未深入開展。本研究應(yīng)用細(xì)胞外源基因轉(zhuǎn)染和免疫缺陷鼠乳腺癌移植模型方法,進一步探討了活體內(nèi)p73α和14-3-3σ對乳腺癌生長的抑制作用,確認(rèn)14-3-3σ的作用機制以及p73α基因?qū)?4-3-3σ的調(diào)節(jié)作用,為乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)
3、和靶向治療提供新的分子生物學(xué)指標(biāo)和靶點。 方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染:將p53缺失型乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長至約70%融合時,用脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)染pcDNA3-p53,pcDNA3-73α和pcDNA3-14-3-3σ質(zhì)粒,按實驗分組:對照組、p53組、p73a組、14-3-3σ組、p53+14-3-3σ組和p73α+14-3-3σ組,分別導(dǎo)入p53突變
4、型人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中,以pcDNA3空質(zhì)粒組為對照組。 2 乳腺癌裸鼠移植模型:選取BALB/C-null 3周齡雌性裸鼠12只,在無特定病原體(specific pathogen free,SPF)環(huán)境下飼養(yǎng)。分組同前,每組2只,其中標(biāo)記鼠為a鼠,未標(biāo)記鼠為b鼠。飼料喂養(yǎng)、2天,待裸鼠狀態(tài)穩(wěn)定后,按照分組,于a、b兩裸鼠腋下分別接種MDA-MB-231,2μg p53,2μgp73α,2 μg 14-3-3σ,2μ
5、g p53+2μg 14-3-3σ和2μg p73α+2 μg14-3-3σ(相當(dāng)于4×106個細(xì)胞)。接種后48 h,b鼠尾靜脈內(nèi)按15 mg/Kg緩慢靜注表阿霉素(adriamycin,ADR)[2],觀察8周后脫頸椎處死裸鼠,計數(shù)腋下腫塊數(shù)量、形態(tài)及大小,解剖乳腺組織取材,標(biāo)本常規(guī)固定,石蠟包埋,4μm切片,HE染色,光鏡觀察。 結(jié)果: 1.MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生長良好。 2.細(xì)胞外源性基因轉(zhuǎn)染成
6、功。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取總RNA進行RT-PCR,檢測p53、p73a、14-3-3σ基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)。結(jié)果表明,(1)p53和p73α均可在轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)14-3-3σ的表達(dá),且14-3-3σ可反作用于p53,兩者相互誘導(dǎo);而14-3-3σ對p73α則無此作用。(2)p53可能參與了p73α對14-3-3σ的調(diào)節(jié)。 3.12只裸鼠在實驗全過程中無死亡。在裸鼠接種腫瘤細(xì)胞后第30天,發(fā)現(xiàn)對照組a鼠(未靜注ADR者)皮下接種處
7、可觸及5 mm×5 mm腫物,質(zhì)硬,表面不平,活動差;第40天發(fā)現(xiàn)14-3-3σ組a鼠皮下接種處可觸及5 mm×3 mm腫物,質(zhì)硬,活動可。至55天脫頸椎處死裸鼠,對照組a鼠腫瘤長至12 mm×7.2 mm,14-3-3σ組a鼠腫瘤長至7.2 mm×6.2 mm,所有組b鼠和其他組a鼠均未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長。對裸鼠腫瘤進行形態(tài)學(xué)觀察,肉眼觀察:包膜多不完整,解剖腫瘤時有砂粒感,切面為黃白色。鏡下觀察:癌細(xì)胞呈實性團索,無腺腔樣結(jié)構(gòu),細(xì)胞體積較
8、小,呈條索狀,周圍有纖維化的癌性間質(zhì)圍繞,細(xì)胞異型性多見,常可見核分裂相,診斷為乳腺癌。結(jié)論: 1.在活體內(nèi),細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子14-3-3σ存在活化和非活化兩種狀態(tài),活化狀態(tài)下的14-3-3σ可以發(fā)揮其抑制腫瘤生長的作用,而非活化狀態(tài)的14-3-3σ無抑制腫瘤生長的作用。 2.p53基因和p73α基因都是14-3-3σ主要的上游調(diào)控基因,當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷時,他們不但可上調(diào)14-3-3σ的表達(dá),而且可使其由非活化狀態(tài)
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