新型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在強直性脊柱炎患者的作用研究.pdf

1、目的:強直性脊柱炎是一種慢性自身免疫性疾病，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在表型和功能上具有異質(zhì)性，由于缺乏特異性標(biāo)志，鑒定和分離有功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其在AS發(fā)病中的作用仍存在較大爭議。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)通過CD39和CD45可進(jìn)一步將CD4+CD25++細(xì)胞分成新型的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，并測定了其在強直性脊柱炎患者中的功能。
　　 方法:采取正常人和患者外周血50～100ml，用流式細(xì)胞染色進(jìn)行表型

2、分析;分別用磁珠和流式分選出調(diào)節(jié)性T細(xì)胞各亞群，和效應(yīng)T細(xì)胞共培養(yǎng)，氫3摻入法、CFSE法測定細(xì)胞增殖，ELISA測定培養(yǎng)上清IFN-g、 IL17分泌。Real-time PCR測定Foxp3亞型。Micoarray測定基因表達(dá)譜。高通量測序TCR-beta CDR3，測定TCR受體庫。
　　 結(jié)果:CD39和CD45RO可進(jìn)一步將CD4+CD25++T細(xì)胞分成3個亞群(G1，G2，G3)。G1(CD39-CD45RO+CD4

3、+CD25++)的Foxp3表達(dá)變異度大，TCR刺激后可以增殖并分泌大量炎性細(xì)胞因子，尤其是IL17。其Foxp3不穩(wěn)定，TCR刺激后表達(dá)迅速下降，無抑制功能。G2（CD39+CD45RO+CD4+CD25++）為Foxp3hi，表型為效應(yīng)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，具有最強的抑制功能，TCR刺激后不能增殖并且很快凋亡。G3(CD39-CD45RO-CD4+CD25++)為Foxp3low，TCR刺激后可以增殖但無炎性細(xì)胞因子分泌，其抑制功能弱于G

4、2細(xì)胞。此外，G3細(xì)胞在體外反復(fù)TCR刺激后可以在表型和功能上誘導(dǎo)擴增為G2細(xì)胞。所以通過CD39和CD45RO可以將Foxp3+ Treg和Foxp3+ Non-Treg(G1)清楚地區(qū)別開，并且將Foxp3+ Treg分為effctor Treg(G2)和na(i)ve Treg(G3)。為進(jìn)一步比較幼稚型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上的不同，我們通過microarray方法進(jìn)一步比較了二者的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)

5、胞功能性相關(guān)的蛋白分子在effector Treg中升高，并且effector Treg高表達(dá)和凋亡相關(guān)的分子，進(jìn)一步提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞已經(jīng)分化成熟。通過高通量測序TCR-beta CDR3，比較各亞群間TCR受體庫的組成，發(fā)現(xiàn)na(i)ve Treg(G3)細(xì)胞的TCR譜很廣，并且都是小克隆，沒有優(yōu)勢克隆，并且和其他3群細(xì)胞沒有克隆覆蓋。Foxp3+Non-Treg(G1)和effector Treg(G2)有一定的克隆覆蓋。他們和效應(yīng)

6、T細(xì)胞(Tresp)都有小部分克隆覆蓋，且G1細(xì)胞多余G2。我們還測定了這3群細(xì)胞在AS患者中的數(shù)量和功能，和正常對照相比，3群細(xì)胞的數(shù)量無明顯差異，但是其Foxp3的陽性率在AS患者中略低于正常人，尤其是na(i)ve Treg(G3)。在功能上，強直性脊柱炎患者Non-Treg(G1)可以分泌更多的炎性細(xì)胞因子IFN-g和IL17，而effctor Treg(G2)和na(i)ve Treg(G3)的抑制功能部分受損。
　　

7、 結(jié)論:在CD4+CD25++的基礎(chǔ)上，CD39結(jié)合CD45RO可以更精確地定義調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，這會測定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在強直性脊柱炎中的作用提供更可靠的表型鑒定。可以將na(i)ve Treg在體外擴增誘導(dǎo)為effector Treg，并且保持高效的抑制功能，為體外細(xì)胞治療提供一個可能的策略。強直性脊柱炎患者中的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)無明顯異常，但是其功能受損，包括效應(yīng)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和幼稚型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。此外，我們還發(fā)現(xiàn)強直性脊柱炎患者外周血