水流動(dòng)力學(xué)進(jìn)行基因免疫制備單克隆抗體.pdf

1、自抗體技術(shù)產(chǎn)生以來，通常以蛋白質(zhì)作為抗原免疫小鼠。這些用于免疫的蛋白質(zhì)通常從組織細(xì)胞中分離提純或通過基因工程表達(dá)，其制備過程操作繁雜，且實(shí)驗(yàn)周期長；有些蛋白質(zhì)的構(gòu)象表位易發(fā)生改變，有些蛋白質(zhì)甚至無法獲得。用合成肽來取代蛋白質(zhì)，價(jià)格昂貴、產(chǎn)量小。 此外SARS以及禽流感、手足口等突發(fā)傳染病不斷地警示我們：突發(fā)傳染性疾病隨時(shí)可能給人類帶來的災(zāi)難。這些突發(fā)傳染病原常常亞型眾多，加上基因突變、重組和重排，使其變異極快，早期血清學(xué)診斷無疑

2、對(duì)預(yù)防、控制其傳播具有重要意義。血清學(xué)診斷的前提是獲得特異性抗體。制備抗體的傳統(tǒng)方法速度慢并且費(fèi)力。 利用基因免疫方法(genetic immunization)制備單抗的原理是將編碼目的蛋白的基因(代替常規(guī)的蛋白質(zhì)抗原)經(jīng)各種基因轉(zhuǎn)移途徑轉(zhuǎn)入機(jī)體細(xì)胞，表達(dá)目的蛋白。目的蛋白在體內(nèi)作為抗原，激發(fā)免疫應(yīng)答，然后進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞融合。基因免疫制備單抗可以制備針對(duì)天然表位的抗體，而且節(jié)省制備單抗時(shí)間2-3個(gè)月，是一種很有前途的抗體制備方

3、法。 目前常用的基因免疫方法，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平由于這種局部注射而相當(dāng)?shù)筒⑶覂H局限在注射部位。通過傳統(tǒng)方法靜脈注射質(zhì)粒DNA，雖然可以使DNA分布在很多器官，但是質(zhì)粒DNA進(jìn)入體內(nèi)后，迅速被血液及組織表面的核酸酶降解并且很快從血液循環(huán)中清除。 為了克服這些問題，1999年Liu及Zhang等經(jīng)小鼠尾靜脈快速注射(3-8 s內(nèi)完成)大體積質(zhì)粒DNA溶液(占小鼠體重的8％-12％)，發(fā)現(xiàn)在短時(shí)間內(nèi)小鼠多種組織中即有目的基因的表

4、達(dá)，其中在肝臟組織中表達(dá)水平最高，這種方法被稱為水流動(dòng)力學(xué)注射(hydrodynamics-based procudure)。應(yīng)用此方法大大提高了質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染效率，從而升高了蛋白的表達(dá)。 水流動(dòng)力學(xué)出現(xiàn)以來，在基因治療方面被得到廣泛的應(yīng)用，但是在基因免疫制備抗體方面卻未有報(bào)道。 死亡受體5(death receptor，DR5)是腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor relate

5、d apoptosis inducing ligand，TRAIL)的主要受體之一，TRAIL可引起許多腫瘤細(xì)胞系的凋亡，對(duì)絕大多數(shù)正常細(xì)胞不具有凋亡效應(yīng)，被認(rèn)為是癌癥治療的潛在的生物制劑。DR5與TRAIL結(jié)合后可以通過其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域傳遞凋亡信號(hào)，從而引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是激活凋亡途徑的很好的靶標(biāo)。 目的： 通過水流動(dòng)力學(xué)方法提高基因轉(zhuǎn)移的效率，從而制備高效價(jià)的血清，并提高基因免疫制備單抗的效率，為制備抗體提供一條

6、新的路徑。 方法： 將DR5基因克隆pcDNA3.0載體中，測序鑒定正確。分別通過水流動(dòng)力學(xué)注射法和常規(guī)肌肉注射方法免疫小鼠，通過免疫組化和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，ELISA測定抗體的效價(jià)。 通過雜交瘤技術(shù)篩選抗DR5單克隆抗體。通過非競爭ELISA方法分析了單抗的親和常數(shù)，通過ELISA方法分析了單抗的亞型，流式細(xì)胞術(shù)檢測單抗與Jurkat細(xì)胞表面的DR5結(jié)合。 結(jié)果： 構(gòu)建了真核

7、表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.0/DR5。通過水流動(dòng)力學(xué)方法和肌肉注射兩種方法免疫小鼠，間接ELISA結(jié)果顯示末次免疫后水流動(dòng)力學(xué)免疫組抗體滴度最高可達(dá)到為1:102400，肌肉注射免疫組抗體滴度最高為1:25600：Western blot結(jié)果顯示小鼠抗DR5多克隆抗體識(shí)別識(shí)別Jurkat細(xì)胞的DR5蛋白條帶。免疫組化結(jié)果表明轉(zhuǎn)染的DR5蛋白主要表達(dá)在食管癌細(xì)胞核膜周圍，與預(yù)期相符。 通過細(xì)胞融合技術(shù)成功制備了一株抗DR5單克隆抗

8、體A9。經(jīng)分析其亞型為IgM，非競爭ELISA結(jié)果顯示A9的親合常數(shù)為1.64×109L/mol。流式細(xì)胞儀檢測顯示A9可以與Jurkat細(xì)胞表面的DR5特異性結(jié)合。 結(jié)論： 本課題以DR5為例，建立了利用水流動(dòng)力學(xué)進(jìn)行基因免疫，制備抗體的新方法。該方法與常規(guī)的蛋白免疫方法相比，具有節(jié)省制備單抗時(shí)間，可以制備針對(duì)天然表位的抗體的優(yōu)點(diǎn)；與肌肉免疫進(jìn)行基因免疫方法相比，可以產(chǎn)生更高效價(jià)的血清，在western-blot試驗(yàn)中