種公雞弱（無）精癥發(fā)生的生理與分子機制初步研究.pdf

1、弱（無）精種公雞因繁殖能力低下而被迫淘汰，據(jù)報道，在群體中無精癥種公雞約占10％～20％。而目前對于雞無精癥發(fā)生機制研究鮮有報道，致使此類問題未得到有效、根本的解決，這給我國正處在發(fā)展關鍵時刻的養(yǎng)禽業(yè)帶來一定損失。因此，對于影響種公雞弱（無）精癥的作用機制探究已是勢在必行。
　　本研究是以雪山雞為研究對象，分別從生理、基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等3個方面對雞無精子癥的發(fā)生機制進行較為系統(tǒng)的探究過程。首先利用生長指標測定、精液品質(zhì)測定及組織

2、學觀察等方法將雞群分為弱（無）精子雞群體和正常生精雞群體;Piwi基因作為睪丸特異性表達基因，在精子生成過程中具有重要作用，缺失導致不能形成成熟精子，因此通過實時熒光定量PCR(Real-Time qPCR，RT-qPCR)法，檢測Piwi(P-element induced wimpytestis)基因在正常、弱（無）精癥雞中不同類型生精細胞中mRNA表達差異，探討Piwil1基因表達水平與產(chǎn)精性能的關系;同時本研究利用PCR-SSC

3、P的方法對Piwil1基因的核心啟動子區(qū)和第一外顯子區(qū)序列共531bp區(qū)域進行遺變異位點檢測，并分析無精癥雞群體中變異位點對基因轉(zhuǎn)錄水平和產(chǎn)精性能的影響，以期尋找有價值的分子遺傳標記。
　　最后采用BSP-克隆測序法對該區(qū)域CG二核苷酸位點分布情況進行檢測，進一步確定其甲基化位點，以期發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生過程中各級生精細胞中Piwil1基因的表達與甲基化調(diào)控間的關系，進而闡明Piwil1基因在雞精子發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律。
　　

4、實驗結果如下:
　　1.根據(jù)雞群對按摩法的反應、產(chǎn)精情況及精液品質(zhì)將雞群分為正常、反應強烈且有精子、反應強烈且無精子、無反應且無精液等四個組別，分別標記為組1、組2、組3和組4。相比之下，組1的精子活力、精子活率顯著高于組2、組3(P＜0.05);且組間精子畸形率差異顯著(P＜0.05)。在不同時間點不同組間的FSH、LH、To、TSHR血漿激素水平存在差異。
　　2.在組1中雞睪丸中的曲細精管上皮結構完整，在組2中雞的曲細

5、精管結構中，未見精子細胞;在組3中未見次級精母細胞及精子細胞;在組4中未見初級、次級精母細胞及精子細胞，僅在靠近基膜存在精原細胞，且深染的精原細胞極少。由此可見，曲細精管組織結構損害較嚴重，僅有少量精原細胞，精子細胞和精母細胞缺失、稀少，致使睪丸組織生精功能喪失。
　　3.檢測Piwil1基因在正常、無精癥雞中不同類型生精細胞中mRNA表達差異，發(fā)現(xiàn)Piwil1在正常雞無精癥雞群中的表達存在顯著差異，且從胚胎中分離的干細胞的Piw

6、il1表達水平較精原細胞低，且在成熟精子中幾乎不表達，進一步表明Piwil1很可能參與精子發(fā)生的減數(shù)分裂過程。
　　4.本實驗擴增出雞群Piwil1基因5'調(diào)控區(qū)及第1外顯子部分序列總長531bp區(qū)域，篩選出2個SNPs;同時檢測出雞Piwil1基因啟動子區(qū)-233～+298bp區(qū)域存在一個CpG島，該島有56個CG二核苷酸位點。第1～10個CG二核苷酸位點（-233～-129bp區(qū)域），精子細胞、四倍體細胞、PGCs、SSCs中

7、處于未甲基化狀態(tài)，而精原細胞中甲基化比例高達0.600;第39～55個CG二核苷酸位點（+105～+252bp區(qū)域），PGCs和SSCs中甲基化比例高于精子細胞、精原細胞、四倍體細胞。PGCs、SSCs中DNA高甲基化在一定程度上抑制了Piwil1基因的表達。
　　綜上，本研究從生理、基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等3個方面進行弱（無）精癥公雞與正常雞差異研究，發(fā)現(xiàn)雞曲細精管上皮結構受損程度與其精子發(fā)生呈負相關;Piwil1基因在精子中表達量