腐胺誘導(dǎo)白樺懸浮細(xì)胞中白樺酯醇積累的生理與分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、本文以產(chǎn)白樺脂醇穩(wěn)定的白樺懸浮細(xì)胞為研究材料，將不同濃度的腐胺(Put)處理白樺懸浮細(xì)胞3h～48h后，分析外源腐胺對(duì)白樺懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和白樺脂醇積累的影響，明確腐胺促進(jìn)白樺脂醇積累的最佳濃度和時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，分析腐胺處理下白樺懸浮細(xì)胞中一氧化氮合成、防御生理、氮代謝與白樺脂醇積累的關(guān)系;同時(shí)，采用蛋白組學(xué)技術(shù)分析腐胺誘導(dǎo)的一氧化氮(NO)參與白樺脂醇積累的分子機(jī)制，主要研究結(jié)果如下：
　　1.為分析不同度腐胺對(duì)白樺懸浮細(xì)胞干重和

2、白樺脂醇積累的影響，用0.1 mmol/L～10mmol/L濃度腐胺處理3～48h，分析細(xì)胞干重、白樺脂醇積累量及其合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L腐胺處理48h對(duì)白樺懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最強(qiáng);1mmol/L腐胺處理12h對(duì)白樺脂醇積累的促進(jìn)作用最強(qiáng)。
　　2.為了明確腐胺處理下防御生理與白樺酯醇積累的關(guān)系，用0.1mmol/L～5mmol/L腐胺處理3～48h，分析防御酶和PAL活性及其基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)低濃

3、度腐胺在一定程度上促進(jìn)防御酶和PAL活性，1mmol/L腐胺對(duì)防御酶和PAL活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，而5mmol/L腐胺抑制了防御酶和PAL活性。不同濃度的外源腐胺可以通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平、影響蛋白質(zhì)翻譯后修飾，或是直接調(diào)控酶的活性等途徑對(duì)白樺懸浮細(xì)胞的防御酶和PAL活性進(jìn)行調(diào)控，引起細(xì)胞的防御反應(yīng)，表明氧迸發(fā)和苯丙烷類(lèi)代謝途徑可能參與了腐胺誘導(dǎo)白樺脂醇的積累。
　　3.為了明確腐胺處理下NO合成及氮代謝與白樺脂醇積累的關(guān)系，用0.1

4、mmol/L～5mmol/L腐胺處理0.5～48h，分析NO含量及其合成酶活性、氮代謝相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)中低濃度腐胺主要通過(guò)NR、NOS途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NO的積累，在處理9h時(shí)NO含量最高，高濃度腐胺促進(jìn)了NO含量增加，卻抑制了白樺脂醇積累，推測(cè)高濃度腐胺誘導(dǎo)后期產(chǎn)生高濃度的NO抑制了植物次生代謝產(chǎn)物合成或是外源腐胺通過(guò)NR/NOS途徑產(chǎn)生的NO介導(dǎo)白樺脂醇的積累;此外1mmol/L腐胺提高了氮代謝與白樺脂醇積累的相關(guān)性，說(shuō)明氮代謝可能參與了

5、腐胺對(duì)白樺脂醇的誘導(dǎo)作用。
　　4.為研究NO是否介導(dǎo)腐胺對(duì)白樺脂醇的誘導(dǎo)作用，用1mmol/L腐胺、1mmol/LSNP、150μmol/L cPITO處理12h，通過(guò)測(cè)定NO含量、NR及NOS活性及白樺脂醇含量及其合成關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腐胺和硝普鈉引起細(xì)胞中NO迸發(fā)、白樺脂醇積累，cPITO處理抑制了腐胺引起的NO迸發(fā)和白樺脂醇積累，但白樺脂醇含量仍顯著高于對(duì)照水平，說(shuō)明NO參與了腐胺誘導(dǎo)白樺脂醇的過(guò)程，同時(shí)外源腐胺也

6、可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)途徑影響白樺脂醇的生物代謝過(guò)程。通過(guò)檢測(cè)β-AS、LUS和CAS基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其與對(duì)白樺脂醇含量較為一致，說(shuō)明腐胺通過(guò)調(diào)控這三個(gè)基因表達(dá)影響白樺脂醇的積累，而加入cPITO后，這幾個(gè)關(guān)鍵合成酶基因的表達(dá)水平上調(diào)受到抑制，進(jìn)一步說(shuō)明NO介導(dǎo)了外源腐胺誘導(dǎo)白樺脂醇積累的過(guò)程。
　　5.為了明確腐胺誘導(dǎo)白樺脂醇積累的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，用1mmol/L腐胺、1mmoFLSNP、150μ mol/L cPITO處理12

7、h，利用iTRAQ技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)組鑒定，共鑒定出4718個(gè)蛋白質(zhì)，其中對(duì)比到其中4360個(gè)蛋白與GO數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，4466個(gè)蛋白與COG數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，有3691個(gè)蛋白被注釋到126個(gè)代謝途徑中，兩兩比較后差異蛋白共有677個(gè)，對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腐胺和硝普鈉可以促進(jìn)與萜類(lèi)合成、轉(zhuǎn)錄、運(yùn)輸相關(guān)蛋白的積累，而cPITO則一定以程度上抑制了腐胺的促進(jìn)作用。這些結(jié)果表明腐胺誘導(dǎo)白樺酯醇積累的作用機(jī)制一部分依賴(lài)于通過(guò)NR途徑產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)源NO以及