硫化氫誘導(dǎo)桑黃菌絲體中白樺酯醇合成機(jī)制的初步研究.pdf

1、本文從四種桑黃菌絲中篩選出白樺酯醇含量高的桑黃菌種為試材，分析硫化氫(H2S)和氯化鈣(CaCl2)對桑黃菌絲體中白樺酯醇積累的影響，分析H2S對菌絲中不同形態(tài)鈣含量及其合成關(guān)鍵酶的活性的影響，同時分析了H2S對桑黃菌絲體轉(zhuǎn)錄水平的影響，主要研究結(jié)果如下:
　　一:H2S和CaCl2誘導(dǎo)桑黃菌絲體白樺酯醇積累的交互作用分析
　　1.分別將終濃度為0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM、15mM、20mM、5

2、0mM的NaHS添加到液體培養(yǎng)的桑黃菌絲體體系中，發(fā)現(xiàn)低濃度的NaHS促進(jìn)了白樺酯醇的合成，而高濃度的NaHS則為抑制作用，其中2mM NaHS促進(jìn)效果最佳，與對照相比含量增加了90.95％。在第4、8、12天將2mM NaHS添到體系中處理12h、24h、48h、72h、96h，發(fā)現(xiàn)除了4d48h和8d12h白樺酯醇含量有所降低之外其余均有所升高，其中8d48h促進(jìn)效果最佳，白樺酯醇含量增長率為112.43％。
　　分別將終濃度

3、為1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、50mM的CaCl2加入到液體培養(yǎng)的桑黃菌絲體體系中，發(fā)現(xiàn)隨著CaCl2濃度的提高白樺酯醇含量逐漸增加，當(dāng)濃度上升到10mM時，促進(jìn)效果最佳，白樺酯醇含量與對照相比增加了102.86％。隨著濃度的繼續(xù)增加白樺酯醇含量曾下降趨勢。在第4、8、12天將10mM CaCl2添到體系中處理12h、24h、48h、72h、96h，發(fā)現(xiàn)均促進(jìn)了白樺酯醇的合成，其中8d96h促進(jìn)效果最佳，與對照相比白樺

4、酯醇含量增加了99.83％。
　　在最佳濃度2mM NaHS處理的基礎(chǔ)上分別加入終濃度為1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、50mM的CaCl2，發(fā)現(xiàn)白樺酯醇含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中2mM NaHS和10mM CaCl2共同處理促進(jìn)效果最佳，白樺酯醇含量與對照相比增加了143.37％。將鈣離子通道阻斷劑加入到2mM NaHS處理的體系中，發(fā)現(xiàn)白樺酯醇含量與單獨進(jìn)行2mM NaHS處理時相比有所降低。綜合上述結(jié)果，

5、可以初步推斷H2S和CaCl2互作提高了白樺酯醇含量。
　　2.將終濃度分別為0.5mM、2mM、10mM，處理時間分別為3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h的NaHS添加到液體培養(yǎng)的桑黃菌絲體體系中，發(fā)現(xiàn)幾種形態(tài)鈣含量和鈣合成關(guān)鍵酶均有不同程度的變化，總體趨勢表現(xiàn)為2mM＞0.5mM＞10mM，其中（2mM、48h）促進(jìn)效果最佳。將鈣離子通道阻斷劑加入到2mM NaHS處理的體系中，發(fā)現(xiàn)形態(tài)鈣含量和鈣合成關(guān)鍵酶活性與

6、單獨進(jìn)行2mM NaHS處理時相比均有所降低。綜合上述結(jié)果，可以推斷鈣介導(dǎo)了H2S的促進(jìn)作用。
　　3.將終濃度分別為0.5mM、2mM、10mM，處理時間分別為3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h的NaHS添加到液體培養(yǎng)的桑黃菌絲體體系中，發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白含量變化趨勢與鈣合成關(guān)鍵酶活性變化基本一致，其中(2mM、48h)促進(jìn)效果最佳，而(10mM、18h)抑制效果最顯著;而超氧陰離子產(chǎn)生速率和總蛋白酶活性與之相反，其中

7、(2mM、48h)抑制效果最佳，而(10mM、18h)促進(jìn)效果最顯著，說明(2mM、48h)的NaHS處理桑黃菌絲體的活性最佳。將鈣離子通道阻斷劑加入到2mM NaHS處理的體系中，發(fā)現(xiàn)可溶性蛋白含量與單獨進(jìn)行2mM NaHS處理時相比均有所降低，而另兩者的變化則相反，說明鈣介導(dǎo)了H2S對桑黃菌絲體活性的促進(jìn)作用。
　　由上可知，H2S和CaCl2互作提高了白樺酯醇含量，鈣介導(dǎo)了H2S促進(jìn)白樺酯醇合成的誘導(dǎo)作用。
　　二:H

8、2S對桑黃菌絲體轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　利用Illumina高通量測序技術(shù)對桑黃菌絲體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序、de novo組裝，結(jié)果表明序列組裝后得到25811條unigene，有19，266條被注釋到NR數(shù)據(jù)庫中，有86.2％的基因與地中海嗜藍(lán)孢孔菌具有較高的同源性;有7831條基因被注釋到COG數(shù)據(jù)庫中，有6845條基因注釋到GO庫中，11088條基因注釋到了108個代謝通路中;對對照(control)、3h的NaHS處理(H2S-3

9、h)、12h的NaHS處理(H2S-12h)、24h的NaHS處理(H2S-24h)這四個樣品間進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜分析，表明control-vs-H2S-3h中共有4836條unigene基因差異表達(dá)，control-vs-H2S-12h中共有4017條unigene基因差異表達(dá)，control-vs-H2S-24h中共有4222條unigene基因差異表達(dá);GO分類結(jié)果與整個轉(zhuǎn)錄組的GO分類結(jié)果一致，它們主要被定位于細(xì)胞結(jié)構(gòu)上、執(zhí)行催