應(yīng)用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記豬鏈球菌2型及實(shí)時(shí)定量PCR分析其體內(nèi)感染動(dòng)態(tài).pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcus suis2，SS2)可以導(dǎo)致豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥、漿膜炎、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等，該病已成為嚴(yán)重影響各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種重要疫病，尤其在高密度的養(yǎng)豬場(chǎng)危害更大。同時(shí)對(duì)從業(yè)人員也帶來(lái)嚴(yán)重的威脅，可以導(dǎo)致人的腦膜炎、心內(nèi)膜炎及中毒性休克綜合癥等嚴(yán)重疾患。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)SS2的研究主要集中在SS2毒力相關(guān)因子上，目前公認(rèn)的毒力相關(guān)因子有溶菌酶釋放蛋白(muramidase released pro

2、tein，MRP)、胞外蛋白因子(extrac-cellular factor protein，EF)、溶血素(suilysin，sly)、莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)、orf2毒力基因(Encodingprotein by orf2，Orf2)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseGAPDH)、谷氨酸脫氫酶(Glutamate de

3、hydrogenase，GDH)等。但是對(duì)于SS2如何突破黏膜屏障后進(jìn)入血流傳播，如何突破腦屏障進(jìn)入腦部等尚不明了。本試驗(yàn)以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(Egfp)為報(bào)告基因，通過(guò)同源重組，構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的SS2重組菌(Egfp-HA9801)，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究其在宿主體內(nèi)的移行機(jī)制，以期闡明SS2的感染機(jī)制。 1.重組質(zhì)粒pESEB的構(gòu)建以溶血素基因(sly)為同源臂的左端，繼溶血素后的1165bp的(bsl

4、y)堿基為同源臂的右端，在兩同源臂的中間加上外源基因Egfp和抗性篩選基因壯觀霉素片段(spr)，將四個(gè)片段分別按序連接到自殺質(zhì)粒pEVP3，經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切鑒定證明在自殺質(zhì)粒pEVP3中插入的4個(gè)目的基因連接正確，成功構(gòu)建了帶有sly-Egfp-spr-bsly基因的重組質(zhì)粒pESBE，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli TOP-10中，獲得高拷貝的增殖，用質(zhì)粒大提試劑盒提取高純度的重組質(zhì)粒pESEB，濃度達(dá)1.5mg/mL。

5、2.Egfp-HA9801重組菌的構(gòu)建用含40 mmol/DL蘇氨酸的新鮮THB培養(yǎng)基將SS2HA9801培養(yǎng)到細(xì)胞濃度為OD600≈0.4后，立即用冰預(yù)冷的無(wú)菌雙蒸水和0.3mol/L蔗糖溶液反復(fù)洗滌后保存在含0.3mol/L蔗糖的15％甘油溶液。經(jīng)優(yōu)化電轉(zhuǎn)化的適宜條件為：1010CFU/mL感受態(tài)細(xì)胞80μL、1.5mg/mL的pESEB重組質(zhì)粒質(zhì)5μL、電阻250Ω、電壓2.3kv、電流25μA。電轉(zhuǎn)結(jié)束后用37℃預(yù)熱的THY培養(yǎng)

6、基培養(yǎng)2h，然后將菌液涂布于含有壯觀霉素的THB平板，挑取壯觀霉素篩選陽(yáng)性克隆。經(jīng)PCR和RT-PCR鑒定，證實(shí)Egfp基因已經(jīng)按試驗(yàn)設(shè)計(jì)準(zhǔn)確地插入到SS2 HA9801染色體中，成功地獲得Egfp-HA9801重組菌，經(jīng)鑒定所構(gòu)建的重組菌在形態(tài)、培養(yǎng)、生化和動(dòng)物致病力等方面沒(méi)有發(fā)生本質(zhì)性變化。 3.實(shí)時(shí)定量PCR分析SS2 HA9801在體內(nèi)的感染動(dòng)態(tài)在Egfp中選取142bp的保守片段作為目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)taqman探針及引物

7、.將該保守片段連接到pMD-19質(zhì)粒，構(gòu)建一個(gè)雙鏈環(huán)狀標(biāo)準(zhǔn)品pMDE，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，優(yōu)化實(shí)時(shí)定量PCR條件。將Egfp-HA9801重組菌和THB培養(yǎng)基按口服和腹腔注射兩種途徑攻毒，在攻毒后8h后，各組處死1只小鼠/1h，取血，心、肝和腦組織，用煮沸法提取DNA模板，根據(jù)優(yōu)化的條件，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)算各樣本的起始拷貝數(shù)。檢測(cè)結(jié)果為：腹腔注射組血液、心臟的DNA平均拷貝數(shù)為6.37×108和5.64×107