四種結(jié)核潛伏感染蛋白制備及免疫學(xué)特性研究.pdf

1、目的:獲得結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)重組蛋白R(shí)v2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c,并評(píng)價(jià)其免疫學(xué)特性及其應(yīng)用價(jià)值。
　　方法:應(yīng)用基因工程技術(shù)克隆、表達(dá)并純化結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白R(shí)v2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c,并對(duì)蛋白表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。進(jìn)一步用純化的重組蛋白R(shí)v2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c刺激376例中國人PBMC,其中包括未感染結(jié)核健康對(duì)照組

2、103例、結(jié)核潛伏感染組51例、活動(dòng)性結(jié)核病組116例、BCG接種組49例(Rv1813c無此組)、非結(jié)核呼吸疾病組57例,用ELISPOT技術(shù)檢測分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞斑點(diǎn)數(shù)(SFC),比較其在不同人群中的差異,評(píng)價(jià)它們?cè)诳菇Y(jié)核潛伏感染細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用;用 ELISA方法檢測未感染結(jié)核的健康對(duì)照組72例、結(jié)核潛伏感染組36例及活動(dòng)性結(jié)核病組62例共計(jì)170例人血清中4種蛋白特異性抗體IgG的水平,并比較組間差異,評(píng)價(jià)4種潛伏感

3、染相關(guān)蛋白在抗結(jié)核體液免疫方面的作用;以潛伏感染組效應(yīng)T細(xì)胞SFC為陽性組,以活動(dòng)性結(jié)核病組SFC為陰性組,繪制各個(gè)潛伏抗原鑒別結(jié)核活動(dòng)性感染與潛伏感染的ROC曲線,在特異度80％及90%兩個(gè)點(diǎn)取SFC的cut-off值,以此評(píng)價(jià)并且比較潛伏感染蛋白對(duì)結(jié)核活動(dòng)性感染與潛伏感染的鑒別診斷效能。
　　結(jié)果:1、本研究制備并獲得純度較高的重組蛋白R(shí)v2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c,其純度均達(dá)到95%以上。2、重

4、組蛋白R(shí)v2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c刺激中國潛伏感染人群后分泌IFN-γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)顯著高于活動(dòng)性結(jié)核病組(p<0.05),也顯著高于未感染正常對(duì)照組(p<0.05);Rv2029c、Rv2659c、Rv1813c在非結(jié)核呼吸疾病組顯著低于結(jié)核潛伏感染組(p<0.05),Rv2628在非結(jié)核呼吸疾病組低于潛伏感染組,但差異不明顯(p>0.05),與未感染健康對(duì)照組無顯著差別(p>0.05);BCG接種3個(gè)

5、月后PPD陽轉(zhuǎn)者與健康對(duì)照組潛伏蛋白特異的SFC值進(jìn)行比較,兩者之間差異不明顯(p>0.05),BCG接種前后潛伏感染蛋白刺激的SFC值無顯著差異(p>0.05)。3、Rv1813c蛋白特異的IgG值在活動(dòng)性結(jié)核病組顯著高于未感染的健康對(duì)照組和潛伏感染組(p<0.05),而其余3個(gè)蛋白特異的IgG水平在這三組間差異不顯著(p>0.05)。4、ROC曲線分析結(jié)果:Rv2029c蛋白的曲線下面積最高達(dá)到89.1%,高于Rv2659c(69.

6、9%)、Rv2628(68.8%)及Rv1813c(39%)。Rv2029c、Rv2659c及Rv2628蛋白誘導(dǎo)潛伏感染組產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答的陽性率最高。進(jìn)一步評(píng)價(jià)各潛伏蛋白對(duì)鑒別結(jié)核活動(dòng)感染與潛伏感染效能,Rv2029c靈敏度最高,在潛伏感染人群中的陽性率達(dá)到80%以上,但在未感染結(jié)核的健康組和活動(dòng)性結(jié)核病組的假陽性率較高;Rv2659c雖然靈敏度不及Rv2029c,但其在未感染結(jié)核的健康組和活動(dòng)性結(jié)核病組的假陽性率低;Rv2628的

7、靈敏度與 Rv2659c相當(dāng),但其假陽性率高于Rv2659c,低于Rv2029c。
　　結(jié)論:1、本研究成功地構(gòu)建了四種結(jié)核潛伏感染相關(guān)蛋白R(shí)v2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c高表達(dá)的基因工程菌株,獲得的重組蛋白純度高。2、Rv2029c、Rv2659c、Rv2628及Rv1813c可被結(jié)核潛伏感染人群識(shí)別,誘導(dǎo)其效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答強(qiáng)于活動(dòng)性結(jié)核病患者。3、重組Rv2659c蛋白通過ELISPOT技術(shù)