四種植物源化合物對甜菜夜蛾酚氧化酶的影響及酶免疫學(xué)研究.pdf

1、酚氧化酶（Phenoloxidase，EC.1.14.18.1，PO），在昆蟲的正常發(fā)育過程中具有重要生理作用：①參與表皮的硬化和黑化；②對卵殼的鞣化作用；③參與傷害防御；④加速傷口的愈合，等等。研究植物源化合物對昆蟲幼蟲酚氧化酶的影響和酶免疫學(xué)作用對開發(fā)以酚氧化酶為靶標(biāo)的新型害蟲控制劑具有重要的理論意義。由于酚氧化酶具有重要的理論意義和發(fā)展前景，大量的研究工作集中在此領(lǐng)域，尋找昆蟲酚氧化酶高效抑制劑成為研究熱點(diǎn)。本文研究了甜菜夜蛾幼蟲

2、酚氧化酶的部分酶學(xué)特性，測定了木犀草素、鬼臼毒素（PPT）、熊果酸（UA）和齊墩果酸（OA）四種植物源化合物對甜菜夜蛾幼蟲酚氧化酶的抑制活性及抑制動力學(xué)，采用攝食毒力法研究了這四種化合物對甜菜夜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響，并初步探討了酚氧化酶在甜菜夜蛾幼蟲生長發(fā)育過程中的免疫學(xué)功能。本文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下。
　　 ⑴對甜菜夜蛾幼蟲酚氧化酶初步純化后研究其部分酶學(xué)特性。①酚氧化酶催化底物最適溫度為40℃，溫度在25-40℃范圍內(nèi)酶穩(wěn)

3、定性較好；最適pH值為6.5，pH在6.0-7.5范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性較好。②部分金屬離子會影響酚氧化酶活性，Mn2+、Zn2+、Fe2+和Mg2+有激活作用，Cu2+和Cu+在低濃度范圍內(nèi)也有激活作用但在較高濃度范圍內(nèi)卻均表現(xiàn)出抑制作用；金屬螯合劑EDTA和DETC能明顯抑制酚氧化酶活性。③部分有機(jī)溶劑能影響酚氧化酶活性，甲醇、乙醇、丙酮和二甲苯四種有機(jī)溶劑有一定的抑制作用且以二甲苯的抑制程度最高。苯和二甲基亞砜（DMSO）在較低濃度范圍內(nèi)

4、對酶也有抑制作用但在較高濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出一定的激活作用，隨后又表現(xiàn)出抑制效果。
　　 ⑵研究了四種植物源化合物木犀草素、鬼臼毒素、熊果酸和齊墩果酸對甜菜夜蛾酚幼蟲酚氧化酶的抑制活性及抑制動力學(xué)，并初步探討了其抑制機(jī)理。研究結(jié)果表明：四種化合物對酶均有一定的抑制作用，抑制中濃度（IC50）分別為0.4685 mmol·L-1、0.2500 mmol·L-1、0.3385 mmol·L-1和0.1701 mmol·L-1。四種化合物

5、均為可逆競爭型抑制劑，抑制常數(shù)(Ki)分別為13.11 mmol·L-1、0.0895 mmol·L-1、0.2013 mmol·L-1和0.09709 mmol·L-1。理論分析后推測，木犀草素的抑制作用與該化合物和底物在羥基部位有一定的結(jié)構(gòu)相似性有關(guān)，鬼臼毒素的抑制作用可能是通過對氧化性物質(zhì)的清除來實(shí)現(xiàn)的，熊果酸的抑制作用可能與該化合物含有羧基有關(guān)，而齊墩果酸的抑制作用可能與該化合物含有羧基有關(guān)，也可能與改變蛋白質(zhì)分子構(gòu)象有關(guān)。

6、r>　　 ⑶以攝食毒力法測定四種植物源化合物對甜菜夜蛾幼蟲生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明，四種化合物對3齡前幼蟲均表現(xiàn)出一定的毒殺活性，處理后11 d，四種化合物的致死毒力LC50分別為2.53 g·L-1、1.84 g·L-1、6.80 g·L-1和6.04 g·L-1；四種化合物對3齡后幼蟲的生長發(fā)育也都具有一定的抑制作用，且對幼蟲體重增長的抑制效果隨著化合物濃度的提高而提高。四種化合物中以鬼臼毒素的抑制作用最好，用2.50 g·L-1

7、濃度處理48 h后，體重增長抑制率可達(dá)到60.01％；以熊果酸的抑制作用最差，用很高濃度（16.0 g·L-1）處理48 h后，體重增長抑制率才能達(dá)到62.58％。四種化合物均能明顯影響到試蟲幼蟲的化蛹及蛹羽化，在既定化合物濃度范圍內(nèi)，化蛹率和羽化率均低于對照，且化蛹率和羽化率隨著化合物濃度提高而降低。四種化合物中以木犀草素對幼蟲化蛹及蛹羽化的影響最強(qiáng)，用1.60 g·L-1濃度的化合物處理幼蟲后，平均蛹重為0.0647 g·頭-1，化

8、蛹率和羽化率分別為36.67％和36.67％；以熊果酸的影響最差，用16.0 g·L-1濃度的化合物處理幼蟲后，平均蛹重為0.0755 g·頭-1，化蛹率和羽化率分別為53.33％和46.67％。
　　 ⑷以大腸桿菌Escherichia coli DH5α菌株為免疫刺激因子，研究了甜菜夜蛾幼蟲在受到細(xì)菌侵染后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及酚氧化酶活性變化。結(jié)果表明，大腸桿菌E.Col水懸浮液與甜菜夜蛾幼蟲血淋巴一起冰浴后，其血淋巴酚氧化酶

9、活性明顯上升，比對照提高112％；將血淋巴進(jìn)行離心除去血細(xì)胞后與E.Coli一起冰浴，則不能使酚氧化酶活性升高；離心后的血漿與胰蛋白酶一起冰浴，隨著胰蛋白酶濃度的升高，酚氧化酶活性也逐漸升高，說明血漿中有酚氧化酶酶原（prophenol oxidase，proPO）存在；研究認(rèn)為試蟲體內(nèi)對入侵病原菌E.Coli起識別作用的識別因子存在于血細(xì)胞或其它大分子的表面。將病原菌E.coli采用注射法注入試蟲體內(nèi)2 h后，試蟲體內(nèi)很快出現(xiàn)黑色的結(jié)