四種園林昆蟲酚氧化酶基本酶學(xué)特性及效應(yīng)物對(duì)其活性的抑制作用.pdf

1、酚氧化酶(Phenoloxidase,EC.1.14.18.1,簡(jiǎn)稱PO)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物等不同生物體內(nèi)。該酶具有單酚酶(Monophenoloxidase,MPO)活性和二酚酶(Diphenoloxidase, DPO)活性,可催化單酚(Monphenols)羥化成二酚(如L-DOPA),并把二酚再度氧化成醌。它是昆蟲體內(nèi)的一種重要酶類,在昆蟲的變態(tài)發(fā)育和免疫系統(tǒng)中起著重要作用。由于酚氧化酶具有重要的理論意義和發(fā)展前景,大

2、量的研究工作集中在此領(lǐng)域,篩選、設(shè)計(jì)、合成酚氧化酶抑制劑成為研究熱點(diǎn)。 本文以2種鱗翅目Lepidoptera昆蟲舞毒蛾Lymantria dispar、淡劍襲夜蛾Sidemiadepravata和2種鞘翅目Coleoptera昆蟲核桃扁葉甲Gastrolina depressa、華北大黑鰓金龜Holotrichia oblita四種園林昆蟲酚氧化酶為試驗(yàn)對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行了部分純化,并分別比較了同一目不同種類及異目昆蟲酚氧化酶的基

3、本酶學(xué)特性,初步探討了幾種金屬離子與幾種有機(jī)溶劑對(duì)這四種昆蟲PO的影響,并在參考前人對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲PO抑制劑以及對(duì)水果、蔬菜護(hù)色劑研究的基礎(chǔ)上,選擇了曲酸、槲皮素、4-十二烷基間苯二酚和4-己基間苯二酚作為效應(yīng)物研究其對(duì)鱗翅目害蟲--舞毒蛾幼蟲酚氧化酶活性的抑制參數(shù)；并選擇抗壞血酸和L-半胱氨酸對(duì)鱗翅目--淡劍襲夜蛾幼蟲和鞘翅目--核桃扁葉甲成蟲為酶源的酚氧化酶的抑制作用進(jìn)行了測(cè)定,其中對(duì)高效抑制劑的抑制動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：

4、 1.經(jīng)不同飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀,將舞毒蛾(Lymantria dispar)、核桃扁葉甲(Gastrolina depressa)、淡劍襲夜蛾(Sidemia depravata)和華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)酚氧化酶部分純化。鱗翅目昆蟲舞毒蛾幼蟲和淡劍襲夜蛾幼蟲酚氧化酶的最大酶活力均存在于35％飽和度硫酸銨溶液沉淀中,兩蟲的最適pH值分別為6.5,7.0,其最適溫度也不相同,分別為35℃和25℃。以鄰苯二酚

5、、焦性沒(méi)食子酸和L-多巴作底物時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物有吸收峰出現(xiàn)(特征吸收峰分別為410、334和465nm),而以對(duì)苯二酚、間苯二酚作底物時(shí)未見明顯吸收峰。L-多巴、鄰苯二酚和焦性沒(méi)食子酸與酶的Km值依次為3.19、10.74和19.26 mmol·L-1。以鄰苯二酚和L-多巴作底物時(shí),反應(yīng)產(chǎn)物有吸收峰出現(xiàn)(特征吸收峰分別為410和475nm),以對(duì)苯二酚、間苯二酚作底物時(shí)也未見明顯吸收峰。以鄰苯二酚和L-多巴為底物的淡劍襲夜蛾酚氧化酶酶促反應(yīng)

6、的米氏常數(shù)Km分別為1.44和37.49 mmol·L-1。鞘翅目昆蟲核桃扁葉甲成蟲和華北大黑鰓金龜成蟲酚氧化酶的最大酶活力均存在于40％飽和度硫酸銨溶液沉淀中,其最適pH值分別為7.5、7.0,兩蟲最適溫度相同均為40℃,以L-多巴和鄰苯二酚為底物時(shí),華北大黑鰓金龜和核桃扁葉甲酚氧化酶的Kow值分別為3.02和61.25mmol·L-1,15.01和9.17 mmol·L-1。 2.研究金屬離子對(duì)四種昆蟲酚氧化酶活力的影響,結(jié)

7、果表明:K+和Na+對(duì)核桃扁葉甲成蟲、淡劍襲夜蛾幼蟲、華北大黑鰓金龜成蟲PO的活性基本沒(méi)有影響；但K+于舞毒蛾幼蟲有輕微的抑制作用。Mg2+對(duì)舞毒蛾幼蟲酚氧化酶有抑制作用；但對(duì)核桃扁葉甲成蟲、淡劍襲夜蛾幼蟲PO有激活作用；Mg2+在低濃度時(shí)對(duì)華北大黑鰓金龜成蟲PO具有激活作用,高濃度時(shí)抑制。Ba2+能激活核桃扁葉甲成蟲、淡劍襲夜蛾幼蟲中的PO,但對(duì)華北大黑鰓金龜PO無(wú)顯著的影響。Cu2+對(duì)舞毒蛾幼蟲、淡劍襲夜蛾幼蟲和華北大黑鰓金龜成蟲P

8、O的影響都是在低濃度時(shí)對(duì)其有激活作用,高濃度時(shí)表現(xiàn)為抑制作用作用。而Cu2+對(duì)核桃扁葉甲成蟲酚氧化酶具有顯著抑制作用。Zn2+對(duì)淡劍襲夜蛾幼蟲PO有激活作用；但對(duì)核桃扁葉甲成蟲PO有顯著抑制作用；該離子在低濃度時(shí)對(duì)舞毒蛾幼蟲和華北大黑鰓金龜成蟲PO有激活作用,高濃度時(shí)表現(xiàn)為抑制作用作用。研究還發(fā)現(xiàn)Mn2+對(duì)淡劍襲夜蛾幼蟲PO無(wú)顯著的激活或抑制作用；但在低濃度時(shí)能激活華北大黑鰓金龜PO,高濃度又起抑制作用。 3.研究有機(jī)溶劑對(duì)四種

9、昆蟲酚氧化酶活力的影響,結(jié)果表明：乙醚能顯著的抑制淡劍襲夜蛾幼蟲和華北大黑鰓金龜成蟲PO的活性。甲醇對(duì)舞毒蛾幼蟲、核桃扁葉甲成蟲、淡劍襲夜蛾幼蟲和華北大黑鰓金龜PO具有顯著的抑制作用。乙醇和丙三醇能抑制核桃扁葉甲成蟲和華北大黑鰓金龜成蟲PO的活性,但是乙醇對(duì)淡劍襲夜蛾幼蟲具有輕微的激活作用,丙酮對(duì)舞毒蛾幼蟲和華北大黑鰓金龜成蟲酚氧化酶有顯著的抑制作用,但對(duì)淡劍襲夜蛾幼蟲酚氧化酶無(wú)顯著的激活或抑制作用。 4.研究效應(yīng)物對(duì)四種昆蟲酚

10、氧化酶活力的抑制作用,結(jié)果表明：以鄰苯二酚為底物時(shí),槲皮素和4-十二烷基間苯二酚都能顯著的抑制舞毒蛾幼蟲酚氧化酶活力,對(duì)舞毒蛾幼蟲酚氧化酶活力的抑制中濃度(IC50)分別為0.076 mmol·L-1和0.372 mmol·L-1,并且這兩種抑制劑都是舞毒蛾幼蟲酚氧化酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,其抑制常數(shù)Ki分別為31.71mmol·L-1和0.192 mmol·L-1。研究4HR和曲酸對(duì)四種昆蟲酚氧化酶的抑制動(dòng)力學(xué),結(jié)果表明：4HR對(duì)該蟲的單酚

11、酶和二酚酶活性均表現(xiàn)很強(qiáng)的抑制作用,其IC50分別為0.00041mmol/L和0.00035 mmol/L。其中,4HR對(duì)單酚酶活力表達(dá)的遲滯時(shí)間有明顯的延長(zhǎng)效應(yīng),濃度為0.0002mmol/L時(shí)可使單酚酶活力表達(dá)遲滯時(shí)間從181 s延長(zhǎng)到253 s;而當(dāng)濃度為0.0005mmol/L時(shí),其遲滯時(shí)間則延長(zhǎng)至372 s。以鄰苯二酚為底物時(shí),4HR對(duì)二酚酶的抑制作用表現(xiàn)為典型的競(jìng)爭(zhēng)型抑制類型,抑制常數(shù)K1為0.00015mmol/L。曲酸

12、對(duì)舞毒蛾的單酚酶和二酚酶活性均表現(xiàn)較強(qiáng)強(qiáng)的抑制作用,其IC50分別為0.06mmol/L和0.92 mmol/L。曲酸對(duì)單酚酶活力表達(dá)的遲滯時(shí)間也有明顯的延長(zhǎng)效應(yīng),濃度為0.1mmol/L時(shí)可使單酚酶活力表達(dá)遲滯時(shí)間從306 s延長(zhǎng)到732 s;而當(dāng)濃度為0.15mmol/L時(shí),其遲滯時(shí)間則延長(zhǎng)至900 s。以鄰苯二酚為底物時(shí),曲酸對(duì)二酚酶的抑制作用表現(xiàn)為典型的競(jìng)爭(zhēng)型抑制類型,抑制常數(shù)K1為0.51 mmol/L。以鄰苯二酚為底物時(shí),核

13、桃扁葉甲成蟲酚氧化酶對(duì)抗壞血酸不甚敏感,抗壞血酸只能抑制該酶大約27％的相對(duì)活性,并且抗壞血酸對(duì)該酶的抑制作用具有可逆效應(yīng)；但淡劍襲夜蛾幼蟲酚氧化酶對(duì)抗壞血酸較為敏感,抗壞血酸對(duì)淡劍襲夜蛾幼蟲酚氧化酶活力抑制中濃度(IC50)為0.36 mmol·L-1,且該抑制劑是淡劍襲夜蛾幼蟲酚氧化酶的一種不可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,其抑制常數(shù)(Ki)為0.0768 mmol·L-1。以鄰苯二酚為底物時(shí),核桃扁葉甲成蟲酚氧化酶對(duì)L-半胱氨酸非常敏感,L-半