多酚氧化酶活性測定及控制[畢業(yè)設(shè)計]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p>　　多酚氧化酶活性測定及控制 　　</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程 &l

2、t;/p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　摘要：研究抑制多酚氧化酶(PPO)活性的方法，為蓮藕保鮮過程中控制褐變提供理

3、論依據(jù)。試驗研究了溫度、pH值、底物濃度以及抑制劑對蓮藕多酚氧化酶(PPO)的影響。結(jié)果表明：蓮藕PPO最適pH值為7.5，最適溫度為35℃。亞硫酸鈉、抗壞血酸(Vc)對蓮藕PPO活性具有較好抑制作用，檸檬酸、半胱氨酸也對蓮藕PPO活性具有一定抑制作用。可以通過浸泡亞硫酸鈉和抗壞血酸(Vc)、調(diào)節(jié)pH值、低溫貯藏等方法來抑制蓮藕PPO活性，控制蓮藕褐變。</p><p>　　關(guān)鍵詞：多酚氧化酶；活性測定；抑制劑

4、 </p><p>　　Activity Determining and Inhibiting Polyphenol Oxidase</p><p>　　Abstract：[Objective] The research ami ed to study the enzymatic characteristics ofPPO in lotus sprou.t [Method] The

5、 effects of temperature, pH value and inhibitorsonPPO activity of lotus sproutwere studied using spectrophotometrymethod, catecholas substrate, and the reaction kinetic equationwas established. [Result] The results showe

6、d that the optmi um temperature and pH were 30℃and 6. 0 respectively. PPOwas inactivitywhen keeping heat in 70℃by 60min. Ascorbic acid, citric acid,L-cysteine and st</p><p>　　Key words： PPO；Inhibitor；Activit

7、y detection</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1選題背景及意義1</p><p>　　1.2 最新研究成果及動態(tài)1</p><p>　　1.2.1 鮮切蓮藕組織中多酚

8、氧化酶的分離純化1</p><p>　　1.2.2 不同小麥多酚氧化酶活性檢測方法的比較1</p><p>　　1.2.3 PPO活性與小麥粉主要理化指標的關(guān)系2</p><p>　　1.2.4 核桃組織培養(yǎng)中外植體褐變多酚氧化酶活性的控制2</p><p>　　1.2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性測定的最佳試驗條

9、件2</p><p>　　1.2.6 純化的蓮藕多酚氧化酶(PPO)與底物和抑制劑相互作用時的二級結(jié)構(gòu)變化2</p><p>　　1.2.7 磁場和抑制劑對蓮藕多酚氧化酶反應(yīng)動力學的影響2</p><p>　　1.2.8 南湖菱果中多酚氧化酶抑制劑對其活性的影響3</p><p>　　1.2.9 二氧化氯(ClO2)對鮮切蓮藕

10、在低溫貯藏期間多酚氧化酶(PPO)的影響3</p><p>　　1.2.10 底物濃度、pH、溫度對鮮切蓮藕中PPO酶的影響3</p><p>　　1.2.11 抑制劑對多酚氧化酶活性的影響3</p><p>　　1.2.12 護色處理對多酚氧化酶活性的影響3</p><p>　　1.2.13 氣調(diào)包裝對鮮切蓮藕的保鮮效果4

11、</p><p>　　2.1 主要試劑及設(shè)備5</p><p>　　2.1.1 實驗材料5</p><p>　　2.1.2 主要試劑與儀器5</p><p>　　2.2 實驗流程6</p><p>　　2.3 分析方法6</p><p>　　2.3.1 粗酶液的制備6&l

12、t;/p><p>　　2.3.2 PPO活性的測定7</p><p>　　2.3.3 溫度對多酚氧化酶活性的影響7</p><p>　　2.3.4 pH對多酚氧化酶活性的影響7</p><p>　　2.3.5底物濃度對PPO活性的影響7</p><p>　　2.3.6 抑制劑對多酚氧化酶活性的影響7&l

13、t;/p><p>　　2.3.7 用抑制劑對自制的粗酶液進行活性測定分析8</p><p>　　3 結(jié)果與分析9</p><p>　　3.1 溫度對PPO活性的影響9</p><p>　　3.2 pH對PPO活性的影響10</p><p>　　3.3 底物濃度對PPO活性的影響10</p>

14、<p>　　3.4 抑制劑對PPO活性的影響12</p><p>　　3.4.1 L-半胱氨酸對25KU多酚氧化酶活性的影響12</p><p>　　3.4.2 單抑制劑對PPO活性的影響13</p><p><b>　　4 結(jié)論15</b></p><p><b>　　參考文獻16<

15、/b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1選題背景及意義</p><p>　　多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)是植物體內(nèi)普遍存在的一種非線粒體內(nèi)的含銅末端氧化酶(Mayer 1987；Mayer&a

16、mp;Harel，1991)。它包括單酚氧化酶、雙酚氧化酶和漆酶。它廣泛存在于自然界，在果實和蔬菜收獲后，PPO所引起的反應(yīng)常常會使果肉發(fā)生褐變、產(chǎn)生異味和損失營養(yǎng)。多酚氧化酶（PPO）作為一種植物酶類，是引起果蔬褐變的主要因素。鮮切果蔬因組織被切分使PPO與酚類底物的接觸機會增加，酚類物質(zhì)被氧化成棕褐色的醌，導致產(chǎn)品褐變。抑制PPO活性取決于抑制劑的性質(zhì)和濃度、底物的可利用性、pH值和溫度。一些還原劑、酶類、螯合劑和蜂蜜等均已被用于防

17、止果蔬酶褐變。本文總結(jié)了多酚氧化酶的活性測定方法以及對其活性的控制，主要研究了抑制劑對其活性的影響，為果蔬貯藏和加工中酶促褐變的防治提供思路。 </p><p>　　1.2 最新研究成果及動態(tài) </p><p>　　1.2.1 鮮切蓮藕組織中多酚氧化酶的分離純化</p><p>　　從鮮切藕中粗提多酚氧化酶，并通過硫酸銨鹽析沉淀，DEAE-SepH-Arose離

18、子交換柱層析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱層析進行純化后，經(jīng)SDS-PAGE電泳確定為單一條帶，表明該酶已被純化到電泳均一。在整個過程中，該酶純化了95.66倍，產(chǎn)率為2.4％。同時研究表明，鮮切蓮藕組織中PPO相對分子質(zhì)量在65 900～66 100之間。</p><p>　　1.2.2 不同小麥多酚氧化酶活性檢測方法的比較</p><p>　　以鄰苯

19、二酚和酪氨酸為底物所測PPO活性極顯著相關(guān)，鄰苯二酚所測活性強，但酪氨酸所測活性的變異系數(shù)大。面粉PPO活性和面粉及面制品色澤的變化相關(guān)性最強,但籽粒和全麥粉中的PPO活性高，變異系數(shù)大。</p><p>　　1.2.3 PPO活性與小麥粉主要理化指標的關(guān)系</p><p>　　PPO活性與小麥粉白度成極顯著負相關(guān)性，與灰分含量成極顯著正相關(guān)性；前路粉流PPO活性比后路粉流低；物料含皮較

20、多的在線粉流PPO活性高；物料來源于小麥胚乳外層的粉流PPO活性高。</p><p>　　1.2.4 核桃組織培養(yǎng)中外植體褐變多酚氧化酶活性的控制 </p><p>　　在抑制PPO活性方面,PVPP作用最明顯,其次是Na2S2O3、AgNO3。</p><p>　　1.2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性測定的最佳試驗條件</p>&l

21、t;p>　　以鄰苯二酚為底物時，底物濃度宜大于20mmol/L，其最適波長為420nm，最適pH值為6.8，最適溫度為50℃，反應(yīng)時間不宜超過20min，反應(yīng)完成后在20min后測定PPO的活性最為穩(wěn)定。抑制劑NaHSO4的有效抑制濃度為0.8mmol/L。</p><p>　　1.2.6 純化的蓮藕多酚氧化酶(PPO)與底物和抑制劑相互作用時的二級結(jié)構(gòu)變化</p><p>　　園

22、二色譜分析表明蓮藕PPO主要含有α一螺旋和β一折疊結(jié)構(gòu)。與抑制劑作用后，蓮藕PPO活性顯著降低，同時伴隨其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)明顯減少，表明蓮藕PPO的活性中心可能位于α-螺旋結(jié)構(gòu)中。熒光分析表明，蓮藕PPO與鄰苯三酚(pyroGAllic Acid，PA)作用后，酪氨酸殘基熒光強度略有降低，入max位移不明顯，色氨酸殘基熒光強度略有降低，入max紅移2 nm；而與蓮藕多酚(LoTus rooT polypHenol，LRP)作用后，

23、蓮藕PPO分子中酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基熒光強度顯著提高，且其最大發(fā)射波長分別藍移6nm和紅移5nm。當加入異Vc鈉后，Tyr和Trp殘基最大發(fā)射峰顯著紅移，說明Trp和防殘基位于一定的疏水環(huán)境對維持PPO催化活性的優(yōu)勢構(gòu)象至關(guān)重要。</p><p>　　1.2.7 磁場和抑制劑對蓮藕多酚氧化酶反應(yīng)動力學的影響</p><p>　　以鄰苯二酚為底物，蓮藕PPO褐變反應(yīng)動力學

24、符合米氏方程所描述的單底物酶促反應(yīng)動力學，Km為0.775mol/L，Vmax為11.150U/min。Vc對PPO有較強的抑制作用，反應(yīng)動力學參數(shù)Km為0.081mol/L，Vmax為3.243U/min，呈現(xiàn)反競爭性抑制，表現(xiàn)為褐變出現(xiàn)滯后，隨Vc濃度的增大滯后時間逐漸增長，且呈現(xiàn)S型趨勢，并建立了相應(yīng)的反應(yīng)方程。不同磁場強度下，隨著處理時間的變化，PPO活性呈現(xiàn)波動性。3.17A/m磁場強度下處理4h的酶液其反應(yīng)動力學曲線表現(xiàn)為S

25、型，并建立了相應(yīng)的反應(yīng)方程。</p><p>　　1.2.8 南湖菱果中多酚氧化酶抑制劑對其活性的影響</p><p>　　南湖菱PPO催化反應(yīng)的最適溫度為30 0C ，最適pH 6.5，最佳吸收波長420 nm ，最大反應(yīng)速度Vmax=33.67 uniT/min，米氏常數(shù)Km= 0.286 mol/L。在3種抑制劑抗壞血酸、EDTA和檸檬酸中，抗壞血酸的抑制效果最好，最佳濃度為0.3

26、 mmol/L。</p><p>　　1.2.9 二氧化氯(ClO2)對鮮切蓮藕在低溫貯藏期間多酚氧化酶(PPO)的影響</p><p>　　100mg／L濃度的ClO2處理鮮切藕片5min、10 min、15 min后，在貯藏期間能抑制PPO的活性，而10 mg／L濃度對PPO的活性不起抑制作用反而促進了PPO的活性．100 mg／L ClO2處理鮮切藕片10 min抑制PPO的活性效

27、果最好。</p><p>　　1.2.10 底物濃度、pH、溫度對鮮切蓮藕中PPO酶的影響</p><p>　　鮮切蓮藕的PPO活性最適反應(yīng)底物濃度為0.02 mol/L，并且底物濃度與PPO活性的關(guān)系完全遵循MicHeAlis-MenTen的酶促動力學性質(zhì)。PPO最適pH值為7.0，pH對PPO的影響顯著，當pH<4.0時，PPO活性顯著下降，可見，調(diào)節(jié)pH值可有效地抑制PPO活

28、力。PPO活性的最適溫度為35℃，在0℃-5℃之間，蓮藕的PPO活性受到明顯的抑制。</p><p>　　1.2.11 抑制劑對多酚氧化酶活性的影響</p><p>　　添加抑制劑可使蓮藕PPO反應(yīng)速率發(fā)生變化。苯甲酸可與酶E結(jié)合生成無活性的二元復合物EI，減小可供鄰苯二酚進攻的游離酶E的濃度，也就降低了酶一底物ES的濃度，而且再增加底物濃度，反應(yīng)速率都不可能達到無抑制劑時的最大速率ym

29、ax，從而破壞了蓮藕PPO的正常催化氧化反應(yīng)系統(tǒng)。</p><p>　　1.2.12 護色處理對多酚氧化酶活性的影響</p><p>　　對鮮切蓮藕褐變抑制的最佳囚子組合為EDTA濃度為0.25% , Vc濃度為0.1%、草酸濃度為0.25%半胱氨酸濃度為0.7%、處理時間為8min。</p><p>　　1.2.13 氣調(diào)包裝對鮮切蓮藕的保鮮效果</p&

30、gt;<p>　　采用8種不同濃度配比的O2、N2和CO2氣體對鮮切蓮藕進行包裝，置于4℃下貯藏，定期測定鮮切蓮藕Vc的含量、多酚氧化酶活性、褐變度以及pH值變化，結(jié)果顯示100％O2組處理的鮮切蓮藕，其外觀最好，多酚氧化酶活性受到抑制。</p><p><b>　　2 實驗部分</b></p><p>　　2.1 主要試劑及設(shè)備</p>

31、<p>　　2.1.1 實驗材料</p><p>　　多酚氧化酶凍干粉、新鮮蓮藕</p><p>　　2.1.2 主要試劑與儀器</p><p><b>　　表2-1 實驗試劑</b></p><p>　　表2-2 實驗儀器</p><p>　　所有實驗用水均為去離子水。<

32、;/p><p>　　表2-3磷酸緩沖液配制方法</p><p>　　2.2 實驗流程 </p><p><b>　　2.3 分析方法</b></p><p>　　2.3.1 粗酶液的制備</p><p>　　勻漿浸提法（勻漿浸提法提取所得粗酶液活性最高，操作簡便，提取所得粗酶液活性高，且可以直接

33、用于研究）</p><p>　　配制pH7.0的NaH2PO4-NaH2PO4緩沖液，加入PVPP2.5g，加入蓮藕50g，用高速組織搗碎機搗碎，4℃下浸提2.5h。用4層脫脂紗布過濾，抽濾，所得濾液即為粗酶液；或在3,000r/min下離心15min，棄沉淀，上清液即為粗酶液。</p><p>　　2.3.2 PPO活性的測定</p><p>　　取濃度0.0

34、5 mol／L，pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液1.5 mL于1 cm比色皿中，加入0.1 mol／L的鄰苯二酚溶液1.0 mL，PPO粗酶液0.5 mL．混勻后在420 nm處比色，酶液加入后開始計時，每30 s記錄1次OD。</p><p>　　單位時間內(nèi)OD值的變化率越大，表明PPO的相對活力越高。</p><p>　　2.3.3 溫度對多酚氧化酶活性的影響</p>&l

35、t;p>　　在l cm比色皿中，加入濃度為0.05 mol／L，pH值為7.0的磷酸鹽緩沖溶液1.5 mL，0.1 mol／L的鄰苯二酚溶液1.0 mL。在20℃-50℃(間隔5℃一個處理)下保溫10 min，加入相同溫度下保溫10 min的PPO粗酶液0.5 mL。在420nm下每隔30 s測定OD值。</p><p>　　2.3.4 pH對多酚氧化酶活性的影響 </p><p&g

36、t;　　分別配制pH3.0,4.0,5.0,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0的磷酸緩沖液，在1.2ml 0.2 mol/L的底物中分別加入上述緩沖液1.6ml,30 ℃水浴，再加入0.5 ml酶液，于420 nm處測OD值，計算酶活力。</p><p>　　底物濃度對PPO活性的影響</p><p>　　分別配制濃度為0.01%，0.04%，0.06%，0.08%，0.09%，0.1

37、% 的鄰苯二酚溶液，用PPO凍干粉配成0.01g/ml的溶液，反應(yīng)底物溶液和酶液測定前在25℃恒溫水浴中保溫l0min；分別在不同底物濃度下測定420nm處的OD值，記錄吸光度的變化。</p><p>　　2.3.6 抑制劑對多酚氧化酶活性的影響 </p><p>　　用PPO凍干粉配成0.01g/ml的溶液，反應(yīng)底物溶液和酶液測定前在25℃恒溫水浴中保溫l0min;波長掃描和酶活測定均

38、在25℃溫度下進行。將100ul酶液加入3m1含10mmo11L鄰苯二酚、pH6.0的磷酸緩沖液中，迅速搖勻后在295nm下測定2min內(nèi)吸光度的變化，反應(yīng)2min后立即加入100μl60mmol/L（1.9%）的L-半胱氨酸溶液，繼續(xù)記錄吸光度的變化。</p><p>　　隔天后用同樣方法測第二次。</p><p>　　2.3.7 用抑制劑對自制的粗酶液進行活性測定分析</p&g

39、t;<p>　　分別配制0.1％抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、硫脲、半胱氨酸5種抑制劑溶液，將100ul酶液加入3m1含10mmo11L鄰苯二酚、pH6.0的磷酸緩沖液中，迅速搖勻后在420nm下測定2min內(nèi)吸光度的變化，反應(yīng)2min后立即加入上述抑制劑，繼續(xù)測定。3 結(jié)果與分析</p><p>　　3.1 溫度對PPO活性的影響</p><p>　　表3-1 溫度對

40、PPO活性的影響</p><p>　　圖3-1 溫度對PPO活性的影響</p><p>　　由圖可知：PPO活性在35℃時最大，30℃時其次。</p><p>　　3.2 pH對PPO活性的影響</p><p>　　表3-2 不同pH下不同時間內(nèi)的OD（420nm）值（35℃）</p><p>　　圖3-2

41、pH對PPO活性的影響</p><p>　　由上圖可知：在pH為7.5-8之間，PPO的活性最大</p><p>　　3.3 底物濃度對PPO活性的影響</p><p>　　表3-3 底物濃度對PPO活性的影響</p><p>　　圖3-3 底物濃度對PPO活性的影響</p><p>　　根據(jù)此圖所得到的趨勢線數(shù)據(jù)

42、如下表：</p><p><b>　　表3-4</b></p><p>　　由圖可知：隨著底物濃度增加，酶促反應(yīng)速度呈現(xiàn)增長趨勢，當?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭葧r，反應(yīng)速度達到最大值并趨于不變。當?shù)孜餄舛?gt;0.08 mol／L時，隨著底物濃度的增大，反應(yīng)速度不再上升。由此得出PPO活性最適反應(yīng)底物濃度為0.08 mol／L。</p><p>　

43、　3.4 抑制劑對PPO活性的影響</p><p>　　3.4.1 L-半胱氨酸對25KU多酚氧化酶活性的影響</p><p>　　表3-5 295nm下L-半胱氨酸對PPO活性的抑制</p><p>　　圖3-4 295nm下L-半胱氨酸對PPO活性的抑制</p><p>　　可以看出：酶活性在第一天比在第二天要強，此外，295nm處測

44、得的吸光度在加入L一半胱氨酸后，吸光度迅速上升，這說明加入L一半胱氨酸之后并沒有抑制PPO的活性，酶促反應(yīng)仍在進行，可能是L-半胱氨酸加入后生產(chǎn)的產(chǎn)物在295nm處的吸收效率很好。</p><p>　　3.4.2 單抑制劑對PPO活性的影響</p><p>　　表3-6 抑制劑對PPO活性的影響</p><p>　　圖5-5 抑制劑對PPO活性的影響</p&

45、gt;<p>　　由圖可知：Vc和NaHSO3對PPO的活性有強烈的抑制作用，NaHSO3對PPO活性的抑制作用更強，其次是半胱氨酸，而硫脲對PPO活性的抑制作用不明顯。</p><p>　　由圖4和圖5 可知：:當加入L一半胱氨酸后，反應(yīng)液顏色立即褪去，420nm處的吸光度迅速降低，而在295nm處以同樣方法測定時，吸光度則迅速升高，而且在加入L一半胱氨酸后的反應(yīng)中，295nm處的吸收速率比420

46、nm處的要大，這說明加入L-半胱氨酸后，生產(chǎn)的物質(zhì)酶在420nm處的吸收效率低，而在295nm下吸收率高。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　1）PO催化的酶促反應(yīng)是引起蓮藕褐變的主要原因。蓮藕PPO的最適溫度是35℃，最適pH值為7.5。因此，可以通過改變pH，低溫貯藏來抑制PPO活性。</p><p>　　

47、2)亞硫酸鈉和Vc均能在低濃度下對蓮藕PPO起到較好的抑制作用。此外，乙酸、檸檬酸適合輔助抑制PPO。而半胱氨酸、硫脲抑制PPO效果不好。</p><p>　　3）這些處理對蓮藕PPO活性及蓮藕褐變均有很好的抑制作用，作用時間也長。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]潘永貴,陳維信.鮮切蓮藕組織中多酚氧化酶

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