結(jié)核潛伏抗原篩選與治療性融合蛋白疫苗的制備.pdf

1、目的：將潛伏期細(xì)菌表達(dá)的優(yōu)勢(shì)抗原與生長(zhǎng)期細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)抗原結(jié)合，有助于開發(fā)保護(hù)效果更好的新型結(jié)核亞單位疫苗。本試驗(yàn)擬篩選免疫原性較強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌潛伏期抗原，制備含結(jié)核菌潛伏期抗原的新型治療性融合蛋白疫苗。進(jìn)一步建立小鼠肺部卡介苗（BCG）潛伏感染模型，并用該模型對(duì)新構(gòu)建的融合蛋白疫苗的治療作用進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。
　　方法：
　　1)在大腸埃希菌中克隆表達(dá)前期利用生物信息學(xué)方法篩選出的HspX、Rv1738、Rv2626c、Rv20

2、07c和Rv3130c五個(gè)與結(jié)核潛伏感染相關(guān)抗原，檢測(cè)它們?cè)诮Y(jié)核病患者、密切接觸者和健康大學(xué)生志愿者中體液免疫和細(xì)胞免疫特征，評(píng)價(jià)上述抗原的免疫原性，篩選出免疫原性最強(qiáng)的抗原。
　　2)通過(guò)基因工程技術(shù)，構(gòu)建融合蛋白pET30a-ESAT6-Rv1738-Rv2626c（LT40）和pET30a-CFP10-HspX（LT28），然后在大腸埃希菌中表達(dá)、得到相應(yīng)的蛋白。
　　3)在小鼠模型上檢測(cè)融合蛋白LT40的免疫原性，即

3、在第0、3、6周分別用蛋白LT40、ESAT6、Rv1738和Rv2626c免疫小鼠三次，末次免疫后6周檢測(cè)小鼠結(jié)核抗原的特異性抗體水平及脾細(xì)胞在結(jié)核抗原刺激下細(xì)胞因子IFN-γ的分泌情況。
　　4)用牛分枝桿菌減毒株卡介苗（BCG）5×106CFU通過(guò)滴鼻的方法造成小鼠肺部感染，感染后2天、4周、8周和12周行肺部結(jié)核菌落計(jì)數(shù)，并肌肉注射地塞米松以降低小鼠的免疫力，連續(xù)干預(yù)3周后隔一周進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。地塞米松干預(yù)后檢測(cè)小鼠肺部BC

4、G的細(xì)菌載量，來(lái)確定潛伏感染模型是否建成。即當(dāng)小鼠肺部組織培養(yǎng)不出分枝桿菌，但經(jīng)地塞米松免疫干預(yù)后，從肺臟組織中培養(yǎng)出了大量的分枝桿菌時(shí)，該模型成功建成。
　　5)利用建立的小鼠肺部BCG潛伏感染模型來(lái)評(píng)價(jià)融合蛋白疫苗的治療作用，使用的融合蛋白包括：ESAT6-Ag85B-MPT64<190-198>-Mtb8.4-Rv2626c(LT70)和LT40，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)LT70對(duì)感染結(jié)核菌的小鼠具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)力。小鼠感染BC

5、G后隨機(jī)分為五組：PBS組、佐劑組、LT40組、LT70組和LT40+LT70組。疫苗組小鼠分別于第12、14和16周用腹股溝皮下注射的方法進(jìn)行疫苗治療干預(yù)，生理鹽水組和佐劑組小鼠同樣注射生理鹽水和佐劑作為對(duì)照。所有小鼠分別于第20、21和22周用肌肉注射地塞米松的方法進(jìn)行免疫干預(yù)，在第25周用頸椎脫臼的方法處死小鼠，進(jìn)行肺臟組織的分離與解剖和眼球取血，將肺臟組織研磨后進(jìn)行BCG菌落計(jì)數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.人群試驗(yàn)結(jié)果表

6、明，在5個(gè)結(jié)核菌潛伏期高表達(dá)的抗原HspX、Rv2626c、Rv2007c、Rv1738和Rv3130c中，在不同人群中抗原的免疫原性強(qiáng)弱依次是Rv1738、Rv2626c、Rv3130c、HspX和Rv2007c。這些抗原的免疫原性在結(jié)核病密切接觸者中均高于健康大學(xué)生志愿者和結(jié)核病患者。相反，在結(jié)核病患者人群中，結(jié)核生長(zhǎng)早期分泌性抗原ESAT6和CFP10引起IFN-γ的分泌水平卻高于健康大學(xué)生志愿者。我們推測(cè)抗原Rv1738、Rv2

7、626c、Rv3130c在保護(hù)機(jī)體免受結(jié)核分枝桿菌侵害過(guò)程中起了不同程度的保護(hù)作用，其中在潛伏感染人群中，Rv1738抗原引起的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答最強(qiáng)，是結(jié)核菌潛伏期的一個(gè)保護(hù)性抗原。
　　2.串聯(lián)結(jié)核桿菌生長(zhǎng)期抗原ESAT6、潛伏期抗原Rv1738和Rv2626c構(gòu)建融合蛋白疫苗LT40，發(fā)現(xiàn)其以包涵體的形式在大腸埃希菌中穩(wěn)定表達(dá)，得到較高純度的蛋白；連接結(jié)核桿菌生長(zhǎng)期抗原CFP10和潛伏期抗原HspX構(gòu)建的融合蛋白LT28

8、在大腸埃希菌中表達(dá)量低，未純化出相應(yīng)蛋白。
　　3.小鼠免疫實(shí)驗(yàn)表明：LT40蛋白可誘導(dǎo)LT40抗原免疫過(guò)的小鼠血清中產(chǎn)生特異性抗體IgG1和IgG2c，可刺激LT40抗原免疫過(guò)的小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌較高水平的IFN-γ，而單個(gè)抗原刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)較弱，提示融合蛋白LT40誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與天然抗原有所不同。
　　4.成功建立小鼠肺部BCG潛伏感染模型。以滴鼻的方式使小鼠肺部感染BCG，12周后小鼠肺部組織培養(yǎng)不出分枝桿菌，但經(jīng)

9、地塞米松免疫干預(yù)后分枝桿菌大量暴發(fā)，從肺臟組織中培養(yǎng)出了大量的分枝桿菌。
　　5.利用建立的小鼠肺部BCG潛伏感染模型來(lái)評(píng)價(jià)蛋白疫苗的治療作用，結(jié)果示：相比其他組，PBS組結(jié)核菌載量較高，說(shuō)明有大量的分枝桿菌在免疫抑制后暴發(fā)；相比 PBS組，疫苗治療組和佐劑組的結(jié)核菌載量均較低，而疫苗治療組（LT40組、LT70組和LT40+LT70組）的結(jié)核菌載量最低。說(shuō)明LT40蛋白和LT70蛋白對(duì)小鼠肺部潛伏感染的BCG有一定的清除作用。<

10、br>　　結(jié)論：
　　1.在與結(jié)核潛伏感染相關(guān)的抗原（HspX、Rv2626c、Rv2007c、Rv1738和Rv3130c）中，Rv1738抗原引起的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答最強(qiáng)，是結(jié)核菌潛伏期的一個(gè)保護(hù)性抗原。
　　2.成功構(gòu)建融合蛋白疫苗LT40，其以包涵體的形式在大腸埃希菌中穩(wěn)定表達(dá)，得到較高純度的蛋白；LT40蛋白可誘導(dǎo)LT40抗原免疫過(guò)的小鼠血清中產(chǎn)生特異性抗體IgG1和IgG2c，可刺激LT40抗原免疫過(guò)的小鼠脾