亞低溫誘導(dǎo)MKP-1保護(hù)TNF-α引起的內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能紊亂和凋亡.pdf

1、研究背景和目的：
　　 臨床研究表明亞低溫療法（32-34℃）在中風(fēng)、腦損傷、心臟驟停等多種疾病中具有顯著的保護(hù)作用。而血管內(nèi)皮與許多病理過程的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。然而，迄今為止，亞低溫在各種原因引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中能否起到保護(hù)作用以及其中的作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究擬探討亞低溫在腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-alpha，TNF-α）引起的內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能紊亂和凋亡中的作用及其中的分子機(jī)理。

2、　　 實驗方法：
　　 用TNF-α處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs），再分別放置于正常溫度（37℃）和亞低溫（33℃）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-6小時。用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白（FITC-BSA）體外通透性實驗檢測單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性、用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色法檢測細(xì)胞內(nèi)纖維狀的肌動蛋白（F-肌動蛋白）骨架、用原位末端標(biāo)記（terminaldUTPni

3、ck-endlabeling，TUNEL）染色法檢測細(xì)胞的凋亡。用免疫印記（westernblot）法檢測半胱氨酸蛋白水解酶-3片段（Cleavedcaspaspe-3，Asp175）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）p38、c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）、熱休克蛋白27（heatshockprotein27，HSP27）、c-Ju

4、n、MAPK激酶3/6（MAPKkinase3/6，MKK3/6）、MAPK激酶7（MAPKkinase7，MKK7）和MAPK磷酸酶-1（MAPKphosphatase-1，MKP-1）的蛋白表達(dá)；另外，用p38MAPK特異性抑制劑SB203580或者JNK特異性抑制劑SP600125預(yù)處理HUVECs，再進(jìn)行TNF-α處理，并對上述各項指標(biāo)進(jìn)行檢測；同時，將HUVECs不加任何刺激劑放置于亞低溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，再檢測MKP-1的蛋白水

5、平和mRNA水平以及p38MAPK和JNK的蛋白表達(dá)；最后用MKP-1的siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs，再進(jìn)行TNF-α處理，同時檢測各項指標(biāo)。
　　 實驗結(jié)果：
　　 （1）TNF-α處理引起單層HUVECs通透性顯著增強(qiáng)、細(xì)胞肌動蛋白骨架重排、和凋亡發(fā)生，而亞低溫能顯著抑制TNF-α引起的這些內(nèi)皮損傷效應(yīng)。
　　 （2）亞低溫抑制TNF-α活化的p38MAPK和JNK信號通路。
　　 （3）亞低溫通過抑制

6、p38MAPK/HSP27信號通路減弱TNF-α引起的內(nèi)皮細(xì)胞肌動蛋白骨架的重排和壓力纖維的形成。
　　 （4）亞低溫對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用是通過抑制p38MAPK和JNK信號通路而實現(xiàn)的。
　　 （5）亞低溫對p38MAPK和JNK的上游激酶MKK3/6和MKK7無明顯影響，但可顯著上調(diào)p38MAPK和JNK的上游磷酸酶MKP-1。
　　 （6）siRNA實驗表明，亞低溫通過誘導(dǎo)MKP-1的表達(dá)抑制TNF-α