白念珠菌多藥耐藥蛋白Cdr1p構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、Cdr1p構(gòu)效關(guān)系的研究有助于深入了解白念珠菌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制。采用定點(diǎn)突變方法獲得TMS1(I514L)、TMS2(L563F)、TMS4(W629L和M631I)、TMS6(A772I和L776F)、TMS8(F1239L和M1246Y)和TMS10(A1324L)變異，在釀酒酵母AD1-8u-菌株中表達(dá)，測(cè)定表達(dá)變異蛋白菌株藥物敏感性的改變，羅丹明6G外轉(zhuǎn)運(yùn)功能的改變，及在氮唑類藥物與羅丹明6G共同作用下外轉(zhuǎn)運(yùn)功能的變化。結(jié)果

2、發(fā)現(xiàn)L776F、M1246Y和A1324L變異引起菌株對(duì)氮唑類藥物敏感性明顯增加；I514L、L563F、L776F、F1239L、M1246Y和A1324L變異引起菌株外轉(zhuǎn)運(yùn)羅丹明6G能力的下降；表達(dá)野生型蛋白菌株中氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和咪康唑與羅丹明6G共同作用時(shí)抑制羅丹明6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)，而表達(dá)變異蛋白菌株中氮唑類藥物與羅丹明6G共同作用下羅丹明6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)能力各異。本研究首次初步證明TMS4、TMS8和TMS10也是Cdr1p重

3、要的底物結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了與底物結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的關(guān)鍵性氨基酸殘基。 Cdr1p的高表達(dá)是白念珠菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制，對(duì)Cdr1p構(gòu)效關(guān)系的研究有助于了解其底物結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，為設(shè)計(jì)合理的Cdr1p抑制劑從而克服白念珠菌耐藥奠定理論基礎(chǔ)。本課題首先將Cdr1p～Cdr4p四種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜區(qū)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，然后將Cdr1p跨膜區(qū)1、2、4、6、8、10的I514、L563、W629、M631、A772、L776、F1

4、239、M1246和A1324氨基酸殘基突變?yōu)镃dr3p相應(yīng)位置上的514L、563F、629L、772I、776F、1239L、1246Y和1324L，構(gòu)建野生型及突變型蛋白的表達(dá)載體。將其在敲除已知轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的釀酒酵母菌株AD1-8u-中表達(dá)。藥物敏感性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各菌株對(duì)藥物敏感性的改變，羅丹明6G外排實(shí)驗(yàn)測(cè)定Cdr1p轉(zhuǎn)運(yùn)能力的變化，氮唑類藥物與羅丹明6G共同作用時(shí)位點(diǎn)變異對(duì)外轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，表達(dá)變異

5、蛋白的菌株對(duì)氟康唑敏感性增加，而L776F、M1246Y和A1324L變異菌株對(duì)酮康唑敏感性增加；I514L、L563F、L776F、M1246Y和A1324L變異菌株對(duì)咪康唑敏感性增加；L776F、M1246Y和A1324L變異菌株對(duì)伊曲康唑敏感性增加。同時(shí)I514L、M631I和A772I變異菌株還對(duì)制霉菌素敏感性提高；而A772I、L776F和M1246Y變異菌株對(duì)茴香霉素敏感性增加；L776F、F1239L和M1246Y變異菌株

6、對(duì)特比萘酚敏感性增加，L776和A1324變異菌株對(duì)維拉帕米敏感性增加，M1246Y變異菌株對(duì)三氟拉嗪、他莫昔芬和麥角甾醇敏感性增加。 羅丹明6G外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)I514L、L563F、L776F、F1239、M1246Y和A1324L變異引起羅丹明6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)減少，提示這些位點(diǎn)可能與羅丹明6G的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。氮唑類藥物氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和咪康唑與羅丹明6G的共同作用下羅丹明6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)表達(dá)野生型蛋白的菌株中四種氮唑

7、類藥物引起羅丹明6G外轉(zhuǎn)運(yùn)能力的降低，說(shuō)明氮唑類藥物和羅丹明6G可能存在共同的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)。變異菌株中四種氮唑類藥物與羅丹明6G的共同作用下羅丹明6G外轉(zhuǎn)運(yùn)能力的變化情況不一致，L563F和M1246Y變異菌株中四種氮唑類藥物抑制羅丹明6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)，氟康唑在I514L和A1324L菌株中不能引起細(xì)胞外R6G濃度降低，I514L、M631I、A772I和F1239L菌株中酮康唑不引起R6G外轉(zhuǎn)運(yùn)的減少，咪康唑在I514L、W629L、M6

8、31I、A772I、L776F和F1239L中不引起細(xì)胞外R6G濃度的下降，而伊曲康唑在I514L、W629L和M631I不引起R6G外轉(zhuǎn)運(yùn)能力的下降。 本研究發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)變異對(duì)氮唑類藥物和R6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)都有影響，不同變異的影響程度不同，而某一位點(diǎn)變異對(duì)氮唑類藥物和R6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)影響程度也不同。首次證實(shí)Cdr1p跨膜區(qū)4、8、10也是重要的底物結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)，跨膜區(qū)1和2也與氮唑類藥物的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，而且進(jìn)一步證明跨膜區(qū)6在底物結(jié)合轉(zhuǎn)

9、運(yùn)中發(fā)揮重要作用。I514(TMS1)位點(diǎn)可能與氮唑類藥物的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，W629和M631(TMS4)位點(diǎn)與咪康唑、伊曲康唑的特異性結(jié)合有關(guān)，L776(TMS6)位點(diǎn)與氮唑類藥物、維拉帕米和R6G的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，F(xiàn)1239(TMS8)位點(diǎn)可能與酮康唑、咪康唑的結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)更相關(guān)，M1246(TMS8)位點(diǎn)與眾多結(jié)構(gòu)各異的底物：氮唑類藥物、羅丹明6G、特比萘芬、麥角甾醇結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，位點(diǎn)A1324(TMS10)與氮唑類藥物和R6G的外轉(zhuǎn)運(yùn)相