白念珠菌耐藥相關(guān)蛋白R(shí)ta2p與脂筏關(guān)系研究.pdf

1、白念珠菌(Candida albicans)是目前深部真菌感染最為普遍的病原菌之一，目前治療白念珠菌感染臨床應(yīng)用較多的是唑類藥物，隨著長期大量廣泛地應(yīng)用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生，由耐藥導(dǎo)致的治療失敗越來越多。因此，需要我們尋找白念珠菌對(duì)唑類藥物的耐藥機(jī)制，為藥物治療提供依據(jù)。在白念珠菌中，脂筏(lipid rafts)也叫做去垢劑不溶膜(detergent-resistant membranes，DRMs)，是細(xì)胞膜上富含麥角甾醇和鞘脂的區(qū)域

2、，其中還包含許多具有重要功能的蛋白，在許多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要的作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，在白念珠菌中，RTA2是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶介導(dǎo)的唑類藥物耐藥的必須基因，并且Rta2p參與了鞘脂成分-長鏈堿二氫鞘氨醇從細(xì)胞膜內(nèi)向細(xì)胞膜外轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，我們推測(cè)Rta2p可能是通過影響脂筏發(fā)揮對(duì)唑類藥物的耐藥作用。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了Rta2p-GFP的融合表達(dá)菌，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)Rta2p可以和脂筏的主要組成成分麥角

3、甾醇共定位，且這種定位會(huì)被麥角甾醇和鞘脂合成通路的抑制劑破壞。接著我們用加入去垢劑TritonX-100的密度梯度超速離心方法提取脂筏，利用Western blot方法考察分離的脂筏，發(fā)現(xiàn)Rta2p與公認(rèn)的脂筏的標(biāo)志性蛋白(PmalpandGaslp同源蛋白)都定位在脂筏區(qū)域，而這種定位也會(huì)被麥角甾醇和鞘脂合成通路的抑制劑破壞。為了研究RTA2缺失對(duì)脂筏的影響，我們首先通過氣-質(zhì)聯(lián)用的方法測(cè)定了親本菌，缺失菌的總甾醇含量，及脂筏區(qū)，非筏

4、區(qū)麥角甾醇的百分含量，用Filipin染色觀察麥角甾醇分布，結(jié)果顯示，兩株菌之間都沒有顯著差異，說明RTA2缺失并不影響麥角甾醇的總含量，在脂筏區(qū)的含量和分布。我們又用蛋白質(zhì)組學(xué)和Western blot方法發(fā)現(xiàn)Rta2p主要影響10個(gè)脂筏區(qū)域蛋白在脂筏區(qū)域的分布。其中，有5個(gè)蛋白(Pma1p，Gas1p同源蛋白，Erg11p，Pmt2p和Ali1p)已經(jīng)被報(bào)道存在于脂筏區(qū)域，而且其中的Erg11p還是白念珠菌中眾所周知的唑類藥物的靶蛋

5、白?？偠灾?，我們的結(jié)果說明Rta2p主要定位在脂筏區(qū)域，而且會(huì)影響脂筏區(qū)域某些特定蛋白的錨定，其在脂筏分布還會(huì)被麥角甾醇和鞘脂合成通路的抑制劑破壞。
　　 不同于常見的唑類藥物的作用機(jī)制，咪康唑除了能夠抑制麥角甾醇合成通路外，還能誘導(dǎo)活性氧(ROS)3在細(xì)胞內(nèi)累積，導(dǎo)致真菌細(xì)胞死亡，在這之前，還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的聚集。有研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母中，脂筏在咪康唑發(fā)揮抗真菌活性的過程中十分重要。我們想要考察在白念珠菌中是否有相同的

6、機(jī)制，以及RTA2缺失是否會(huì)影響咪康唑的抗真菌活性。
　　 在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先通過點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)(Spotassay)發(fā)現(xiàn)，在白念珠菌中RTA2缺失不會(huì)影響白念珠菌對(duì)咪康唑的敏感性。接著我們?cè)谝吧桶啄钪榫锌疾熘ひ种苿?duì)(1)測(cè)定咪康唑抗真菌活性(2)咪康唑誘導(dǎo)的活性氧累積量(3)咪康唑誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白聚集的影響，發(fā)現(xiàn)用麥角甾醇或者鞘脂合成通路抑制劑(甲基β環(huán)糊精或依地福新)破壞脂筏會(huì)抵抗咪康唑的抗真菌活性，以及其誘導(dǎo)的活性氧累積

7、和肌動(dòng)蛋白聚集。為了探索Rta2p是否參與了咪康唑這一抗真菌活性機(jī)制，我們同時(shí)對(duì)RTA2缺失菌(rtα2△/△)做了與野生菌相同的實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)在單用咪康唑的情況下，RTA2缺失菌和親本菌的生存率，活性氧累積量以及肌動(dòng)蛋白聚集情況都沒有顯著差別。但在同時(shí)加入脂筏抑制劑(甲基β環(huán)糊精或依地福新)后，RTA2缺失能夠與脂筏抑制劑協(xié)同抑制咪康唑發(fā)揮抗真菌作用。綜上所述，Rta2p是一個(gè)脂筏區(qū)蛋白，能夠通過影響某些脂筏區(qū)蛋白分布發(fā)揮作用。還能與