應(yīng)激對兔在體心缺血預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)作用的影響及機(jī)制.pdf

1、已經(jīng)證實(shí)缺血預(yù)適應(yīng)有心肌保護(hù)作用，并且在不同種屬的在體心、離體灌注心和心肌培養(yǎng)細(xì)胞中得到證實(shí)。經(jīng)典IPC機(jī)制認(rèn)為，亞致死的損傷刺激造成內(nèi)源性保護(hù)介質(zhì)釋放，這些介質(zhì)作為第一信使通過G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)激活胞內(nèi)以PKC活化為中心的細(xì)胞保護(hù)通路，從而啟動細(xì)胞本身固有的保護(hù)作用，伴隨應(yīng)激啟動的兒茶酚胺物質(zhì)也可作為第一信使協(xié)同保護(hù)，那么，應(yīng)激反應(yīng)只是附帶的協(xié)同了這種機(jī)制，還是整體上積極的參與或者主導(dǎo)了IPC作用?本研究首次將應(yīng)激系統(tǒng)從IPC

2、中分離出來以期分別考察應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)部固有保護(hù)通路各自在心肌保護(hù)中的作用。實(shí)驗(yàn)分以下四個(gè)部分： 第一部分去應(yīng)激缺血再灌注動物模型的建立。 目的：考察依托咪酯對應(yīng)激反應(yīng)的削弱作用及其循環(huán)穩(wěn)定性，建立藥物去應(yīng)激動物模型。 方法：24只日本大白兔隨機(jī)分為4組(n=6)：1)IPC組；2)依托咪酯一次劑量組； 3)依托咪酯兩次劑量組；4)對照組。實(shí)驗(yàn)中監(jiān)測心率及平均動脈壓變化，同時(shí)多時(shí)點(diǎn)采血測血漿皮質(zhì)醇濃度。 結(jié)果

3、：依托咪酯兩次劑量組(DOSE2)組平均動脈壓基本在90-118mmHg之間，心率在165±31 beat/min-192±23 beat/min之間，T3-T8各時(shí)間點(diǎn)血漿皮質(zhì)醇濃度依托咪酯兩次劑量組(DOSE2)與IPC組比較，P<0.05。 結(jié)論：依托咪酯二次劑量組明顯鈍化皮質(zhì)醇反應(yīng)，并能保持心率、平均動脈壓的相對穩(wěn)定。 第二部分應(yīng)激系統(tǒng)對心肌缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的影響。 目的：考察削弱了應(yīng)激反應(yīng)的缺血預(yù)適應(yīng)

4、心肌保護(hù)作用的變化。 方法：30只家兔隨機(jī)分為5組，缺血預(yù)適應(yīng)組(IPC)；缺血再灌注組(IR)；依托咪酯組(Etom)；甲基強(qiáng)的松龍組(MP)；對照組(control)。以心肌梗死面積/缺血面積、血清肌酸激酶(CK)活性和血清肌鈣蛋白I(cTnI)濃度為檢測指標(biāo)，同時(shí)檢測血清皮質(zhì)醇動態(tài)變化。 結(jié)果：IPC組、Etom組、IR組和MP組和control組心肌梗死面積/缺血面積分別為5.9％±2.8％，11.3％±3.6％

5、，26.8％±44.5％， 18.2±3.7％，CK活性增高值(U/L)分別為255±89，768±404，855±371，314±160，120±41，cTNI增高值(μg/l)分別為3.6±0.6，6.4±1.6，8.1±3.6， 6.1±2.2，1.8±0.2。Etom組與IPC組比較，各指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：鈍化皮質(zhì)醇反應(yīng)可明顯削弱IPC的保護(hù)作用，提示IPC保護(hù)作用中可能有應(yīng)激反應(yīng)的參與。

6、 第三部分應(yīng)激系統(tǒng)對缺血預(yù)適應(yīng)心肌細(xì)胞凋亡的影響。 目的：考察削弱了應(yīng)激反應(yīng)的缺血預(yù)適應(yīng)心肌細(xì)胞凋亡的變化及其分子機(jī)制。 方法：實(shí)驗(yàn)分組同第二部分，以DNAladder、TUNEL染色、Hoechst染色考察心肌細(xì)胞的凋亡程度。用免疫組織化學(xué)方法顯示bcl-2和bax在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 結(jié)果：Etom組DNA ladder顯示的條帶比IPC組明顯增多，TUNEL染色計(jì)算的凋亡率分別為IPC組1.7％±0.2％，MP

7、組2.3％±0.8％， IR組3.8％±1.3％，Etom組3.0％±0.4％。Hoechst染色計(jì)算的凋亡率分別為IPC組3.5％±0.4％，MP組4.1％±0.9％，IR組7.6％±0.4％，Etom組6.2％±1.6％。兩種方法所測凋亡率Etom組與IPC組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MP組與IR組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化染色顯示IPC組、Etom組、IR組、MP組的bcl-2/bax比值，以積分光密度比值測量分別為0.597±

8、0.047，0.178±0.030，0.146±0.181，0.168±0.021；以陽性面積比比值測量分別為O.740±0.102，0.251±0.055，0.197±0.048，0.213±0.023。Etom組與IPC比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MP組與IR組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：鈍化應(yīng)激反應(yīng)可削弱IPC的細(xì)胞凋亡抑制作用，其機(jī)制可能是通過削弱IPC的Bcl-2/bax上調(diào)表達(dá)作用實(shí)現(xiàn)的，甲基強(qiáng)的松龍可抑制缺血再灌注

9、損傷的心肌細(xì)胞凋亡，但可能與bcl-2/bax表達(dá)無關(guān)。 第四部分應(yīng)激系統(tǒng)對IPC的PKC膜向遷移的影響。 目的：考察削弱應(yīng)激反應(yīng)對PKC膜向遷移的影響。探究應(yīng)激反應(yīng)影響缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。 方法：實(shí)驗(yàn)分4組(n=6)：1)IPC組，2)缺血再灌組(IR)， 3)依托咪酯組(Etom)，4)甲基強(qiáng)的松龍組(MP)。均在原擬缺血30min的缺血期進(jìn)行到10min時(shí)采集心臟標(biāo)本，分離胞膜胞漿蛋白組分，分別用

10、酶活性和蛋白印跡檢測PKC的膜向遷移程度。 結(jié)果：Etom組、IPC組、IR組和MP組的PKC膜向遷移指數(shù)以酶活性檢測的分別為0.32±0.06，0.38±0.04，0.25±0.03，0.29±0.03；以westem-blotting測定的分別為0.49±0.08，0.58±0.06，0.47±0.06，0.50±0.04，Etom組與IPC組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MP組與IR組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：IPC可促使P

11、KCε膜向遷移，削弱了應(yīng)激反應(yīng)使PKCε膜向遷移減少，應(yīng)激促進(jìn)PKCε的膜向遷移從而協(xié)同缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用可能是它的分子機(jī)制之一。甲基強(qiáng)的松龍的心肌保護(hù)作用可能與PKCε膜向遷移無關(guān)。 總結(jié)：鈍化皮質(zhì)醇反應(yīng)可明顯削弱IPC的保護(hù)作用，削弱應(yīng)激的促PKCε膜向遷移從而減弱缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用可能是它的分子機(jī)制之一。鈍化應(yīng)激反應(yīng)可削弱IPC的細(xì)胞凋亡抑制作用，其機(jī)制可能是通過削弱IPC的Bcl-2/bax上調(diào)表達(dá)作用實(shí)現(xiàn)的。創(chuàng)新點(diǎn)：

12、 1、從應(yīng)激功能和整體水平拓展經(jīng)典的IPC理論，首次將應(yīng)激系統(tǒng)在缺血預(yù)適應(yīng)心肌保護(hù)中的作用分離出來，并研究了其可能的分子機(jī)制。將缺血預(yù)適應(yīng)的機(jī)制從理論上進(jìn)一步拓展，經(jīng)典的缺血預(yù)適應(yīng)理論可能也是應(yīng)激系統(tǒng)的細(xì)胞反應(yīng)部分。 2、非手術(shù)法去應(yīng)激動物模型的建立。依托咪酯藥物去應(yīng)激動物模型的建立為基礎(chǔ)和臨床研究提供簡單可靠的研究工具。 展望： 這一理論上的創(chuàng)新可能為心肌預(yù)適應(yīng)方式的選擇提供一種新的思路，預(yù)適應(yīng)發(fā)現(xiàn)已有3

13、0年歷史，但遲遲不能在臨床上應(yīng)用，主要原因就在于預(yù)適應(yīng)缺血損傷的直觀性和其保護(hù)作用的間接證據(jù)性，因此，如果繞過預(yù)適應(yīng)中缺血損傷操作，行各種模式的應(yīng)激激發(fā)干預(yù)，或者藥物對應(yīng)激的兩大核心反應(yīng)軸進(jìn)行調(diào)制模擬出應(yīng)激，如果起到保護(hù)作用，其臨床推廣可行性相對較好，尋求預(yù)適應(yīng)保護(hù)可能只是尋求合適的應(yīng)激模式。不足：離體灌注心和心肌細(xì)胞培養(yǎng)的IPC證明細(xì)胞固有保護(hù)通路可不依賴應(yīng)激參與而存在，但要研究應(yīng)激對IPC的影響只能用在體心臟，在體心完全屏蔽掉下丘腦

14、-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸和交感腎上腺軸理論上不可能實(shí)現(xiàn)，依托咪酯抑制了應(yīng)激反應(yīng)下丘腦一垂體前葉一腎上腺皮質(zhì)軸的主要產(chǎn)物皮質(zhì)醇，對交感腎上腺軸幾乎沒有影響，事實(shí)上只相當(dāng)于抑制了應(yīng)激反應(yīng)的部分功能，所以本課題題目定為皮質(zhì)醇對IPC保護(hù)作用的影響似乎更為妥貼，但考慮到皮質(zhì)醇是應(yīng)激反應(yīng)激素網(wǎng)絡(luò)的最重要的成分，理論上講，打破了應(yīng)激反應(yīng)各組分的平衡應(yīng)該對應(yīng)激造成很大干擾，從功能上講，事實(shí)上對應(yīng)激反應(yīng)造成了負(fù)面影響，并且，本課題重心在于應(yīng)激對IPC的影響