細(xì)胞膜鈣調(diào)節(jié)蛋白在心肌缺血預(yù)適應(yīng)及藥物誘導(dǎo)預(yù)適應(yīng)中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：對缺血預(yù)適應(yīng)(IPC)現(xiàn)象產(chǎn)生機(jī)制的研究有望為心肌缺血/再灌注損傷的防治提供一個新的途徑。前人的研究顯示細(xì)胞內(nèi)鈣離子([Ca2+]i)的變化與IPC有密切關(guān)系。心肌缺血早期即發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高是IPC必不可少的觸發(fā)因素；維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)是IPC保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。以往認(rèn)為細(xì)胞膜L-鈣通道是心肌缺血/再灌注時細(xì)胞內(nèi)鈣超載的Ca2+來源，近來研究發(fā)現(xiàn)鈉鈣交換蛋白(NCX)是缺血/再灌注時Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的主要途徑，且在缺血早

2、期阻斷NCX鈣流入模式(外向電流)可有良好的心肌保護(hù)作用。但目前對于細(xì)胞膜鈣調(diào)節(jié)蛋白在缺血/再灌注及IPC各階段中具體的作用機(jī)制包括基因表達(dá)及蛋白活性的改變并未完全明確。利用IPC作用機(jī)制中的活性產(chǎn)物模擬的藥理性預(yù)適應(yīng)雖在動物實(shí)驗(yàn)中可取得良好的心肌保護(hù)作用，但臨床療效欠佳。本研究從基因轉(zhuǎn)錄及蛋白活性方面觀察細(xì)胞膜鈣調(diào)節(jié)蛋白在IPC及藥理性預(yù)適應(yīng)中功能的改變，以探討其在IPC始動環(huán)節(jié)中的可能作用。并采用中藥白花前胡的有效單體前胡丙素誘導(dǎo)I

3、PC樣的心肌保護(hù)作用，以尋找安全有效的保護(hù)心肌藥物并探討其可能的作用機(jī)制。 方法：1.以改良的Simpson等的方法進(jìn)行SD乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)建立缺血/再灌注及IPC模型及腺苷、前胡丙素干預(yù)模型，全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、臺盤蘭染色法記數(shù)細(xì)胞死亡率、透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行浴?.設(shè)立缺血/再灌注組、IPC組、腺苷預(yù)處理組、前胡丙素預(yù)處理組、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ(calmodulin-dep

4、endentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ)抑制劑KN-93+IPC組、KN-93+腺苷預(yù)處理組、KN-93+前胡丙素預(yù)處理組及正常對照組。檢測各組LDH漏出量；半定量RT-PCR檢測NCX基因轉(zhuǎn)錄改變；液閃儀測定Na+依賴的Ca2+攝取率的方法檢測NCX蛋白活性改變，定磷比色法檢測細(xì)胞膜鈣ATP酶(plasmamembranecalciumatpase,PMCA)蛋白活性變化。 結(jié)果：1.模擬缺血4h后LDH漏出率、

5、細(xì)胞死亡率與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，并隨缺血時間延長LDH漏出率及細(xì)胞死亡率逐步升高。2.培養(yǎng)細(xì)胞以模擬缺血90min、再灌60min后進(jìn)行9h長時缺血、1h再灌注，與單純9h長時缺血、1h再灌注組比較顯著降低LDH漏出率及細(xì)胞死亡率(P＜0.01)。長時間缺血/再灌注前在培養(yǎng)基中加入終濃度100μmol/L的前胡丙素或終濃度10μmol/L的腺苷預(yù)培養(yǎng)1h顯著降低LDH漏出率及細(xì)胞死亡率(P＜0.01)。透射電鏡下觀

6、察，單純?nèi)毖?再灌注組見染色質(zhì)碎裂邊集，肌漿網(wǎng)囊泡狀變性，線粒體空泡狀變；IPC組及腺苷預(yù)處理組、前胡丙素預(yù)處理組基本保持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)完整，少數(shù)線粒體空泡狀變。3.缺血預(yù)適應(yīng)組與腺苷預(yù)處理組、前胡丙素預(yù)處理組在降低心肌細(xì)胞缺血/再灌注時LDH漏出量(P＜0.001)，同時也降低缺血/再灌注時鈉鈣交換蛋白轉(zhuǎn)錄水平及蛋白活性的上調(diào)(P＜0.01；P＜0.005)；這些作用被KN-93阻斷。4各組之間PMCA活性無明顯差別(P＞0.05)。