調(diào)免毓麟湯對(duì)雄性大鼠免疫性不育的作用及其機(jī)理研究.pdf

1、目的:本課題旨在從理論上闡明“腎虛肝實(shí)”是免疫性不育的基本病機(jī)，采用同種異體主動(dòng)免疫法建立雄性大鼠免疫性不育疾病模型，觀察調(diào)免毓麟湯對(duì)模型大鼠精液參數(shù)、睪丸組織結(jié)構(gòu)、精液酸性磷酸酶、睪丸生精細(xì)胞凋亡、大鼠睪丸bcl-2、bax表達(dá)以及雄鼠抗精子抗體(AsAb)轉(zhuǎn)陰率、配對(duì)雌鼠妊娠率的影響，初步揭示免疫性不育的病理機(jī)制和調(diào)免毓麟湯的治療機(jī)理。 方法: ①本實(shí)驗(yàn)在120只3月齡sD雄性大鼠中隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組，另取6

2、0只大鼠給予雙側(cè)腹股溝皮下淋巴結(jié)周?chē)?、頸背部脊柱兩側(cè)皮下六個(gè)部位各注射抗原進(jìn)行免疫，7天后于上述相同部位加強(qiáng)免疫，分別于初次免疫前及每次加強(qiáng)免疫后斷尾取血10ul，分離血清，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)血清AsAb。經(jīng)過(guò)四次免疫后，有57只大鼠血清AsAb為陽(yáng)性。將57只抗精子抗體陽(yáng)性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、醋酸強(qiáng)的松組、調(diào)免毓麟湯低劑量組、調(diào)免毓麟湯中劑量組、調(diào)免毓麟湯高劑量組分別灌胃給藥。其中正常組及模型組灌服生理

3、鹽水，調(diào)免毓麟湯各劑量組灌服調(diào)免毓麟湯煎劑，醋酸強(qiáng)的松組灌服醋酸強(qiáng)的松溶液，均每日一次，連續(xù)30天。 ②觀察調(diào)免毓麟湯對(duì)模型大鼠精液參數(shù)影響，分別在光鏡和透射電鏡下觀察睪丸組織形態(tài)學(xué)變化。 ③采用酸性磷酸酶(ACP)試劑盒檢測(cè)大鼠精液ACP，測(cè)定調(diào)免毓麟湯對(duì)模型大鼠精液ACP活性的影響。 ④用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組大鼠生精細(xì)胞凋亡情況。 ⑤采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組大鼠睪丸組織凋亡相關(guān)基因bcl-2、

4、bax 的表達(dá)情況。 ⑥統(tǒng)計(jì)調(diào)免毓麟湯對(duì)模型大鼠AsAb轉(zhuǎn)陰率以及與配對(duì)雌鼠合籠后的妊娠率和胚胎數(shù)。 結(jié)果: ①模型大鼠精液參數(shù)變化：模型大鼠精子密度、活率、直線運(yùn)動(dòng)速度等精液參數(shù)顯著下降，與正常組及各治療組比較有極顯著性差異(P<0.01)；醋酸強(qiáng)的松組大鼠精液參數(shù)與調(diào)免毓麟湯中、高劑量組比較有顯著性差異(P<0.05)。 ②睪丸組織顯微、超微結(jié)構(gòu)觀察：光鏡下可見(jiàn)模型組大鼠睪丸曲細(xì)精管萎縮，管腔內(nèi)上皮變

5、薄，部分生精細(xì)胞核固縮、變性，間質(zhì)水腫，部分間質(zhì)細(xì)胞空泡變性。調(diào)免毓麟湯各劑量組與醋酸強(qiáng)的松組睪丸組織各級(jí)生精細(xì)胞增加，曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)趨于完整，其睪丸組織的病理?yè)p害均有不同程度的修復(fù)，調(diào)免毓麟湯中、高劑量組較之醋酸強(qiáng)的松組的修復(fù)作用更好。透射電鏡觀察可見(jiàn)模型組睪丸支持細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞的損傷最嚴(yán)重：支持細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，各級(jí)生精細(xì)胞核周間隙增寬，線粒體腫脹，精子細(xì)胞少見(jiàn)。治療組對(duì)于睪丸支持細(xì)胞與各級(jí)生精細(xì)胞的損傷均有修復(fù)作用，調(diào)免毓

6、麟湯中、高劑量組能明顯減輕生精細(xì)胞的受損程度。 ③模型大鼠精液 ACP 活性變化：模型組大鼠精液 ACP 活性顯著下降，與正常組比較有顯著性差異(P<0.01)；醋酸強(qiáng)的松組 ACP 活性與調(diào)免毓麟湯中、高劑量組比較有極顯著性差異(P<0.01)；調(diào)免毓麟湯中、高劑量組間比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 ④模型大鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡數(shù)、凋亡率測(cè)定：模型組大鼠睪丸生精細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，醋酸強(qiáng)的松組凋亡細(xì)胞數(shù)及凋亡率低于

7、模型組，兩者比較有極顯著性差異(P<0.01)；調(diào)免毓麟湯低劑量組與醋酸強(qiáng)的松組比較差異不顯著(P>0.05)；調(diào)免毓麟湯中、高劑量組與醋酸強(qiáng)的松組比較有極顯著性差異(P<0.01)。 ⑤模型大鼠睪丸組織凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況：與正常組比較，模型組大鼠睪丸組織bcl-2蛋白表達(dá)下降，bax蛋白表達(dá)上升；與模型組比較，調(diào)免毓麟湯中、高劑量組大鼠睪丸組織bcl-2蛋白表達(dá)顯著上升，bax蛋白表達(dá)顯著下降。 ⑥實(shí)驗(yàn)各組大鼠AsA

8、b轉(zhuǎn)陰率及與配對(duì)雌鼠合籠后胚胎數(shù)、妊娠率的統(tǒng)計(jì)：治療第30天，調(diào)免毓麟湯各劑量組與醋酸強(qiáng)的松組比較有顯著性差異(P<0.05)，調(diào)免毓麟湯各劑量組之間比較差異不顯著(P>0.05)；統(tǒng)計(jì)妊娠率及每胎胚胎數(shù)顯示，調(diào)免毓麟湯各劑量組與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)；調(diào)免毓麟湯各劑量組與醋酸強(qiáng)的松組比較有顯著性差異(P<0.01)。 結(jié)論:本課題提出了“腎虛肝實(shí)”是免疫性不育基本病機(jī)的觀點(diǎn)，根據(jù)中醫(yī)基本理論闡釋了免疫性不育的發(fā)

9、病機(jī)理。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)免毓麟湯能顯著提高模型大鼠精子密度、活率及直線運(yùn)動(dòng)速度，對(duì)睪丸組織的病理?yè)p害具有良好的修復(fù)作用；調(diào)免毓麟湯高劑量組能顯著提高模型大鼠精液ACP的活性，從而抑制AsAb的產(chǎn)生，提高生育力；調(diào)免毓麟湯中、高劑量組能顯著降低模型大鼠生精細(xì)胞凋亡率，提高模型大鼠各級(jí)生精細(xì)胞數(shù)量；調(diào)免毓麟湯能上調(diào)抑凋亡基因bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因bax蛋白的表達(dá)；調(diào)免毓麟湯能使模型大鼠AsAb轉(zhuǎn)陰，調(diào)免毓麟湯各劑量組妊娠率

10、、每胎胚胎數(shù)均高于醋酸強(qiáng)的松組及模型組。 免疫性不育的病機(jī)責(zé)之于腎虛肝實(shí)，而虛實(shí)夾雜是其特點(diǎn)。根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》“虛則補(bǔ)之，實(shí)則瀉之”的原則，調(diào)免毓麟湯緊扣“腎虛肝實(shí)”病機(jī)，以補(bǔ)益腎氣，清利濕熱，活血化瘀立法，共奏腎肝同治，補(bǔ)瀉兼施之功，從而起到糾正免疫紊亂、恢復(fù)正常免疫功能的作用。調(diào)免毓麟湯通過(guò)在不同環(huán)節(jié)和機(jī)制上發(fā)揮作用，能使免疫性不育大鼠血清AsAb轉(zhuǎn)陰，顯著提高模型大鼠的生育力。其功效也反證了免疫性不育“腎虛肝實(shí)”病機(jī)理論的科學(xué)