TLR7-8配體R-848體內(nèi)外抑制小鼠IgE的產(chǎn)生及作用機制的探討.pdf

1、變態(tài)反應性疾病(allergic disease)是指機體免疫應答的異?；蜻^強所導致的疾病。在臨床上通常將由Ⅰ型超敏反應引起的疾病稱之為變態(tài)反應性疾病，包括哮喘、過敏性鼻炎等。在過去的近半個世紀，世界范圍內(nèi)尤其是在西方發(fā)達國家，哮喘和過敏性鼻炎等變態(tài)反應性疾病有了顯著的增加。 流行病學數(shù)據(jù)顯示，在過去幾十年變態(tài)反應性疾病發(fā)病率得顯著增加與細菌或病毒感染性疾病得減少相伴隨。人們注意到“衛(wèi)生”的生活環(huán)境可能增加變態(tài)反應性疾病的發(fā)病風

2、險。1989年，Strachan在過敏性鼻炎的流行病學研究基礎(chǔ)上，提出了衛(wèi)生假說(hygiene hypothesis)，即生活的“衛(wèi)生化”能夠增加變態(tài)反應性疾病的發(fā)病風險。兒童(尤其是嬰幼兒)的免疫系統(tǒng)偏向Th2細胞介導的免疫應答，機體需要在合適的時間接受適當?shù)丨h(huán)境刺激(如自然發(fā)生的感染或接觸微生物)，使免疫系統(tǒng)Th1/Th2的比例達到平衡。隨著人們生活環(huán)境的“衛(wèi)生化”以及醫(yī)療條件的改善使得感染減少，導致兒童尤其是嬰幼兒時期接觸微生物

3、的機會減少，機體免疫系統(tǒng)的Th1/Th2比例失衡，在變應原、遺傳背景的綜合作用下，變態(tài)反應性疾病的發(fā)病率就呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。 衛(wèi)生假說的免疫學基礎(chǔ)是：變態(tài)反應性疾病是以Th2免疫應答為主。研究證明Th2細胞因子IL—4或IL-13誘導IgE的產(chǎn)生，而IgE在變態(tài)反應性疾病的病理形成過程中起著非常重要的作用。IgE在正常人體內(nèi)含量很低，在變態(tài)反應性疾病患者體內(nèi)IgE的含量明顯升高。IgE的重鏈末端可與肥大細胞、嗜堿性粒細胞等細胞

4、上的IgE受體FcεRⅠ高親和力結(jié)合，機體處于致敏狀態(tài)；當再次接觸相同變應原后，變應原與致敏的肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面的IgE特異性結(jié)合，導致炎性介質(zhì)地釋放和合成，從而介導Ⅰ型超敏反應(即變態(tài)反應性疾病)的發(fā)生。IgE的產(chǎn)生受機體的嚴密調(diào)控：B細胞經(jīng)抗原活化后，在Th2細胞分泌的細胞因子IL—4或IL-13以及其表面分子CD40L的輔助下，經(jīng)過類別轉(zhuǎn)化，分化為漿細胞產(chǎn)生的。研究發(fā)現(xiàn)IFN—γ和IL-12能夠負調(diào)控IgE的產(chǎn)生。

5、 目前，針對變態(tài)反應性疾病的治療手段主要是藥物對癥治療來改善患者的臨床癥狀。雖然傳統(tǒng)的變應原免疫治療能夠改變疾病的進程，但因自身的局限性使其在臨床的應用受到限制。因此尋求新的有效的治療方法就顯得非常重要。 R—837(Imiquimod)為可溶性小分子免疫調(diào)節(jié)劑，屬咪唑喹啉類化合物，通過TLR7發(fā)揮作用。經(jīng)美國FDA批準，用于外生殖器疣、肛周疣，及日光性角化病和基底細胞癌等病的治療。替代R—837的某些化學基團研制而成其類似物

6、R—848，其作用強于R—837。R—848主要通過TLR7/MyD88途徑和TLR8發(fā)揮作用。TLR7/8的配體R—848不但能夠誘導pDCs和mDCs分別產(chǎn)生IFN—α和IL-12，還能上調(diào)其協(xié)同刺激分子CD40、CD80和CD86的表達增強DCs的抗原提呈功能，從而誘導初始CD4+T細胞分化為Th1細胞。 本論文研究的主要目的是：利用TLR的配體模擬微生物感染，觀察：1.R—848在體外對B細胞的作用，以及對anti—CD

7、40+IL—4誘導B細胞產(chǎn)生IgE的調(diào)節(jié)及其機制；2.R—848在體內(nèi)對OVA+ALUM誘導IgE的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。該研究將為R—848進一步用于治療變態(tài)反應性疾病提供理論依據(jù)。 本論文研究的內(nèi)容主要有以下三個部分： 第一部分，探討R—848在體外單獨對B細胞的作用包括對小鼠B細胞地活化、分裂和抗體產(chǎn)生的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)R—848能夠直接作用于B細胞，促進B細胞活化和分裂。更重要的是，R—848以劑量依賴方式誘導小鼠脾細胞產(chǎn)生

8、IgG2a和IgG1，且以IgG2a的產(chǎn)生為主。R—848誘導小鼠脾細胞產(chǎn)生IgG2a和IgG1，其機制可能與其誘導IFN—γ．IL—6、IL-10有關(guān)。R—848對B細胞的作用或許是其作為佐劑在體內(nèi)增強免疫應答的一個原因。 第二部分，探討R—848在體外對anti—CD40+IL—4誘導的小鼠脾細胞產(chǎn)生IgE的調(diào)節(jié)及其機制。結(jié)果表明R—848以劑量依賴方式在早期抑制anti—CD40+IL—4誘導的脾細胞產(chǎn)生IgE。檢測其他I

9、g亞類IgG1和IgG2a，發(fā)現(xiàn)R—848同時也抑制anti—CD40+IL—4誘導的脾細胞產(chǎn)生IgG1，對IgG2a的產(chǎn)生無明顯影響。R—848抑制IgE的產(chǎn)生部分是通過增強anti—CD40+IL—4誘導的脾細胞產(chǎn)生細胞因子IFN—γ和IL-12，因為抗IFN—γ或抗IL-12的中和抗體部分逆轉(zhuǎn)R—848介導的IgE抑制作用。另外，R—848抑制anti—CD40+IL—4誘導的脾細胞中B細胞的增殖和分裂，與其抑制IgE的產(chǎn)生有關(guān)。

10、進一步實驗證明R—848能夠直接作用于B細胞抑制anti—CD40+IL—4誘導的純化B細胞產(chǎn)生IgE。 第三部分，探討R—848在體內(nèi)對OVA+ALUM誘導的IgE產(chǎn)生的作用，以及對OVA誘導的體液免疫應答的影響。結(jié)果顯示R—848能抑制OVA+ALUM誘導的血清中OVA特異性IgE和總IgE的產(chǎn)生，不抑制OVA+ALUM誘導的血清中OVA特異性IgG1的產(chǎn)生，同時增強血清中OVA特異性IgG2a的產(chǎn)生。進一步檢測脾細胞OVA

11、特異性Th2細胞因子IL—4和Th1細胞因子IFN—γ，結(jié)果顯示R—848能夠抑制OVA+ALUM免疫小鼠的脾細胞OVA特異性IL—4的產(chǎn)生，而促進OVA特異性IFN—γ的產(chǎn)生。FACS檢測結(jié)果顯示R—848能夠減少多克隆活化的Th2細胞的頻率。R—848與OVA共同免疫，增強血清中OVA特異性IgG2a的產(chǎn)生，對OVA特異性IgG1無明顯影響。由上述結(jié)果可知R—848在體內(nèi)能夠抑制OVA+ALUM誘導的OVA特異性IgE和總IgE的產(chǎn)