2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩96頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、研究背景和目的 臨床研究表明,心肌肥大是高血壓、心臟瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等臨床常見疾病的一種并發(fā)癥,是心肌細(xì)胞對(duì)多種病理刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)。初期的心肌肥大有一定的代償意義,但持續(xù)性心肌肥大,最終可導(dǎo)致心力衰竭,甚至猝死。因此,積極探明心肌肥大的發(fā)生機(jī)制,必將有利于減少心血管事件的發(fā)生。 粘著斑激酶(focaladhesionkinase,F(xiàn)AK)是一個(gè)多功能非受體型酪氨酸激酶,是細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞

2、紐,其磷酸化可促進(jìn)心肌肥大的發(fā)生發(fā)展。粘著斑相關(guān)非激酶(FAKrelatednon-kinase,F(xiàn)RNK)是FAK基因剪接產(chǎn)生的不具催化活性的C末端序列,其分子中缺乏FAK的N末端和激酶結(jié)構(gòu)域。FRNK與FAK一樣,都具有粘著斑定位序列(focaladhesiontargetingsequence,F(xiàn)AT),因此可與FAK競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合粘著斑,進(jìn)而特異性阻斷FAK的磷酸化。那么,作為FAK的一種抑制性同源蛋白,F(xiàn)RNK是否可以通過影響參與心

3、肌肥大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,從而減輕甚至逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大呢?它對(duì)體內(nèi)壓力超負(fù)荷所致病理性心肌肥大的治療作用又如何呢?帶著這些疑問,本文從血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的體外乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型和腹主動(dòng)脈狹窄所致體內(nèi)心肌肥大大鼠模型兩個(gè)層面研究了FRNK基因治療對(duì)心肌肥大的影響。 方法 首先根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道的FRNKcDNA序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,并分別在上下游引物的5'端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)逆

4、轉(zhuǎn)錄得到FRNKcDNA全長(zhǎng)序列。利用BamHⅠ/EcoRⅠ酶切位點(diǎn)連接至真核表達(dá)載體pcDNA3.1上,構(gòu)建pcDNA3.1-FRNK重組質(zhì)粒,并進(jìn)行限制性酶切分析和測(cè)序鑒定。 然后原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)建立體外心肌肥大模型,并用脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-FRNK重組質(zhì)粒或pcDNA3.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞。測(cè)定心肌細(xì)胞表面積和蛋白質(zhì)含量。半定量RT-PCR法檢測(cè)心肌肥大特征性基因心鈉肽(ANP)mRNA的表達(dá)

5、。Westernblot法檢測(cè)心肌細(xì)胞FRNK、磷酸化FAK、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、ERK1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)信號(hào)分子的蛋白表達(dá)。 最后將雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠制備腹主動(dòng)脈狹窄模型,隨機(jī)分成:FRNK組(n=10)、pcDNA3.1組(n=9)及單純手術(shù)組(n=8)。其中FRNK組和pcDNA3.1組在術(shù)后1周,按4.0mg/kg體重劑量經(jīng)尾靜脈分別注射重組質(zhì)粒(pc

6、DNA3.1-FRNK)或空質(zhì)粒(pcDNA3.1),3周后按相同劑量重復(fù)注射。假手術(shù)組(n=9)僅游離腹主動(dòng)脈但不結(jié)扎。術(shù)后7周,通過左心導(dǎo)管測(cè)定各項(xiàng)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)心功能;測(cè)定大鼠心臟重量/體重和左室重量/體重;心肌組織苦味酸天狼猩紅染色評(píng)價(jià)心肌間質(zhì)膠原沉積情況;RT-PCR檢測(cè)心肌肥大特征性基因心鈉肽(ANP)mRNA的表達(dá)。Westernblot分析導(dǎo)入基因后各組大鼠心肌組織中FRNK及磷酸化FAK的蛋白表達(dá)。 結(jié)果

7、 成功克隆FRNK功能片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-FRNK,限制性核酸內(nèi)切酶酶切初步鑒定正確后,經(jīng)序列測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)所得片段序列與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道完全一致。 通過脂質(zhì)體介導(dǎo)pcDNA3.1-FRNK轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,可明顯下調(diào)經(jīng)AngⅡ觸發(fā)的心肌細(xì)胞表面積和ANPmRNA表達(dá)水平的增高(P<0.05),心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FRNK后,高表達(dá)外源性FRNK基因,并可顯著抑制由AngⅡ引起的FA

8、K磷酸化。FRNK干預(yù)后的心肌細(xì)胞與肥大心肌細(xì)胞相比,p-AKT和p-ERK1/2蛋白表達(dá)量下降,而總AKT、ERK1/2蛋白表達(dá)無顯著性差異。 將pcDNA3.1-FRNK經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入大鼠心肌肥大模型后,可引起血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)LVEDP下降,LVPSP及±dp/dtmax上升。FRNK組大鼠心臟重量/體重、左心室重量/體重明顯下降,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常,心肌間質(zhì)膠原沉積不明顯,心肌組織ANPmRNA水平亦顯著下降。經(jīng)pcDNA3

9、.1-FRNK干預(yù)后的大鼠心肌組織高表達(dá)FRNK蛋白,而FAKTyr397磷酸化水平下調(diào)。 結(jié)論 本研究證實(shí): ①pcDNA3.1-FRNK可抑制體外血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大反應(yīng);該抑制作用與FRNK下調(diào)FAK磷酸化水平,繼而影響下游信號(hào)分子ERK1/2、AKT的活化相關(guān); ②將攜帶FRNK基因的真核表達(dá)載體經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入至腹主動(dòng)脈狹窄所致的大鼠心肌肥大模型體內(nèi),可在心肌組織有效高表達(dá),并顯著抑制心肌

10、肥大引起的FAK磷酸化。 ⑨FRNK還可顯著抑制心肌肥大時(shí),間質(zhì)和血管周圍膠原沉積,并改善心肌肥大大鼠的心功能。這一研究結(jié)果為心肌肥大的治療開創(chuàng)了全新的思路。 研究背景和目的 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。近來研究表明FAK是乳腺癌惡性表型的標(biāo)志物,其持續(xù)激活與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。以往實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)細(xì)胞發(fā)生異常增殖的重要機(jī)制之一是細(xì)胞周期調(diào)控功能的失常。FAK作為胞漿內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,其關(guān)鍵性活化位點(diǎn)——T

11、yr397發(fā)生自身磷酸化后能顯著促進(jìn)細(xì)胞周期的行進(jìn)。一旦FAK活化受抑,則導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,從而影響腫瘤細(xì)胞惡性增殖。FRNK是FAK基因單獨(dú)表達(dá)其C末端結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的同源蛋白,它和FAK一樣,都具有粘著斑定位序列(focaladhesiontargetingsequence,F(xiàn)AT),可與FAK競(jìng)爭(zhēng)粘著斑結(jié)合位點(diǎn),但FRNK缺乏FAK的激酶活化區(qū),遂不能引起FAK介導(dǎo)的下游信號(hào)分子活化,因此是FAK良好的內(nèi)源性抑制劑。但目前有關(guān)FRNK

12、如何干擾細(xì)胞周期,抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚不清楚?;谏鲜隼碚摶A(chǔ),本研究以課題1中成功克隆的FRNK基因作為研究對(duì)象,觀察其對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435細(xì)胞周期的影響,探討FRNK抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。 方法 經(jīng)脂質(zhì)體分別介導(dǎo)攜帶目的基因FRNK的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-FRNK)、陽性對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1-GFP)和空質(zhì)粒(pcDNA3.1)轉(zhuǎn)染MDA-MB-435細(xì)胞,以正常MDA-

13、MB-435細(xì)胞作為空白對(duì)照。通過檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞FRNK蛋白的表達(dá),并結(jié)合轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GFP后細(xì)胞表達(dá)熒光的多寡來評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后48h,利用Westernblot檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞FAK活化關(guān)鍵性位點(diǎn)Tyr397的自身磷酸化水平。采用MTT法分析轉(zhuǎn)染后12h、24h、48h和72h各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞周期的影響,并檢測(cè)各組細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65的表達(dá)。 結(jié)

14、果 pcDNA3.1-FRNK質(zhì)??山?jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)染MDA-MB-435細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞FRNK的表達(dá),F(xiàn)RNK表達(dá)量在轉(zhuǎn)染后48h達(dá)高峰。高表達(dá)FRNK的乳腺癌細(xì)胞的FAKTyr397位點(diǎn)磷酸化受到顯著抑制。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FRNK后,MDA-MB-435細(xì)胞增殖趨緩,且這種抑制增殖呈一定的時(shí)間依賴性;S+G2/M期的細(xì)胞比例較正常細(xì)胞顯著下降(P<0.05=;MDA-MB-435細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白表達(dá)減少。

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論