新型TLR配體Zymosan--A的輻射防護(hù)作用及其初步機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　近年來，核能與輻射技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于民用、醫(yī)療及軍事領(lǐng)域，核能在給人類帶來巨大福利的同時，也為人類的健康帶來了巨大的威脅與挑戰(zhàn)。電離輻射導(dǎo)致的放射性損傷已經(jīng)成為國民經(jīng)濟(jì)、社會發(fā)展和國防建設(shè)中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題之一。深入研究和探索輻射損傷防護(hù)新靶點(diǎn)，研制新型高效的輻射損傷防護(hù)劑具有重要的意義。
　　2008年Science主刊首次報道TLR5激動劑CBLB502在動物體內(nèi)具有明顯的輻射防護(hù)作用，使得TL

2、R及其TLR相關(guān)配體在電離輻射防護(hù)研究領(lǐng)域得到了越來越多的關(guān)注，此后科學(xué)家們相繼發(fā)現(xiàn)靶向激活TLR2/TLR4/TLR9均具有明顯的輻射防護(hù)效果。前期通過對TLR及其相關(guān)配體進(jìn)行大量預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，并最終篩選得到一種新型TLR配體Zymosan-A，Zymosan-A又稱酵母多糖，是一類通過β-1，3糖苷鍵連接的葡聚糖，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其具有明顯的輻射防護(hù)效果。
　　在本課題中，開展了Zymosan-A的輻射防護(hù)作用及其初步機(jī)制的研究。

3、本研究課題中主要分為三個部分，分別是Zymosan-A的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究，Zymosan-A的輻射防護(hù)效應(yīng)研究和Zymosan-A的輻射防護(hù)效應(yīng)初步機(jī)制探索。
　　研究目的:
　　1.系統(tǒng)性研究Zymosan-A對在體動物，輻射敏感組織和體外細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)。
　　2.對Zymosan-A的輻射防護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行初步探索，試圖篩選潛在輻射防護(hù)新靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　1.Zymosan-A溶解。

4、　　Zymosan-A購買自Sigma公司，采用生理鹽水溶解配制不同濃度梯度溶液。
　　2.Zymosan-A的急性毒性實(shí)驗(yàn)。
　　(1)采用小鼠體內(nèi)急性動物實(shí)驗(yàn)，經(jīng)腹腔注射給予小鼠不同劑量梯度Zymosan-A，連續(xù)觀察其10天生存期，評價Zymosan-A對整體動物的急性毒性。
　　(2)采用CCK-8細(xì)胞活力檢測方法，給予不同細(xì)胞不同濃度梯度Zymosan-A刺激24小時后，采用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活力的變化。

5、　　3.Zymosan-A的輻射防護(hù)效應(yīng)研究。
　　(1)小鼠急性放射損傷模型的建立。采用本教研室設(shè)計的C57BL/6小鼠固定模型固定小鼠，使用海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心60Co Gamma射線源對小鼠進(jìn)行大劑量單次Gamma射線照射，制備小鼠急性放射性損傷模型。
　　(2)Zymosan-A對整體動物的防護(hù)效應(yīng)。對小鼠進(jìn)行不同劑量單次Gamma射線照射后計算照后小鼠生存率及平均存活時間，繪制生存曲線評價Zymosan-A對整體動

6、物的防護(hù)效應(yīng)。
　　(3)Zymosan-A對體外細(xì)胞的防護(hù)效應(yīng)。照后24小時采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測受照細(xì)胞的細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡率，評價Zymosan-A對體外細(xì)胞的防護(hù)效應(yīng)。
　　(4)Zymosan-A對受照小鼠輻射敏感組織的防護(hù)效應(yīng)。采用動物血細(xì)胞分類計數(shù)儀檢測受照小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)目變化;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測受照小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)目變化和凋亡情況;采用稱量方式計算受照小鼠脾臟臟器指數(shù);采用病理HE染色方法檢

7、測受照小鼠骨髓微結(jié)構(gòu)、血竇出血等情況。
　　4.新型TLR配體Zymosan-A輻射防護(hù)初步機(jī)制探討。
　　(1)采用TLR2/4基因敲除小鼠初步驗(yàn)證Zymosan-A的防護(hù)機(jī)制。對TLR2，TLR4基因敲除小鼠進(jìn)行大劑量單次Gamma射線照射，計算照后基因敲除小鼠生存率及平均存活時間，繪制生存曲線。
　　(2)Zymosan-A對受照小鼠體內(nèi)輻射防護(hù)細(xì)胞因子的調(diào)控作用。對小鼠進(jìn)行大劑量單次Gamma射線照射后，通過酶

8、聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢查照后小鼠體內(nèi)輻射防護(hù)細(xì)胞因子的表達(dá)水平。
　　(3)Zymosan-A對受照小鼠骨髓原代細(xì)胞的凋亡抑制作用。對小鼠進(jìn)行大劑量單次Gamma射線照射24小時后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠骨髓原代細(xì)胞的凋亡水平的變化。
　　(4)Zymosan-A對受照小鼠骨髓原代細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平作用。對小鼠進(jìn)行大劑量單次Gamma射線照射24小時后，通過流式細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)檢測骨髓原代細(xì)胞胞內(nèi)GM-CSF，G-

9、CSF，IL-12和IL-6的表達(dá)水平變化。
　　(5)Zymosan-A對受照小鼠造血干細(xì)胞的輻射防護(hù)作用。對小鼠進(jìn)行大劑量單次Gamma射線照射，照后24小時用流式細(xì)胞術(shù)檢測造血干細(xì)胞的比例變化。
　　(6)Zymosan-A對DNA損傷反應(yīng)的影響。對AHH-1進(jìn)行Zymosan-A藥物刺激后進(jìn)行單次Gamma射線照射后，檢測γ-H2AX foci的形成以評價Zymosan-A對照射引起DNA損傷雙鏈斷裂的影響。

10、　　(7)RNA-SEQ方法鑒定Zymosan-A輻射防護(hù)的新效應(yīng)分子及信號通路。照射前24小時和2小時采用腹腔注射的方式給予C57BL/6小鼠Zymosan-A，隨后對小鼠進(jìn)行大劑量單次Gamma射線照射，照后24小時取小鼠骨髓原代細(xì)胞，裂解紅細(xì)胞后提取RNA進(jìn)行RNA-SEQ。隨后計算基因表達(dá)量并分析樣品間差異表達(dá)基因，并對差異基因進(jìn)行熱圖分析，GO分析和KEGG生物通路富集分析。
　　研究結(jié)果:
　　1.新型TLR配體

11、Zymosan-A的急性毒性實(shí)驗(yàn)
　　(1)小鼠體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)。通過小鼠體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)計算得出Zymosan-A藥物半致死劑量約為666.7mg/kg，而試驗(yàn)中每只小鼠最佳給藥劑量為25/kg mg+25mg/kg，遠(yuǎn)低于其藥物半致死劑量。
　　(2)體外細(xì)胞急性毒性實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)中細(xì)胞最佳給藥劑量為40μg/ml，遠(yuǎn)低于藥物致死劑量。
　　2.新型TLR配體Zymosan-A的輻射防護(hù)效應(yīng)研究。
　　(1)小鼠

12、急性放射損傷模型的建立。采用本教研室設(shè)計的C57BL/6小鼠固定模型固定小鼠，使用海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心60Co源對小鼠進(jìn)行單次大劑量Gamma射線照射，制備小鼠急性放射性損傷模型。
　　(2)Zymosan-A對整體動物的輻射防護(hù)損傷效應(yīng)。生存期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多個劑量照射條件下，照射給藥組較單純照射組小鼠生存率明顯提高;平均存活時間明顯延長。
　　(3)Zymosan-A對體外細(xì)胞的輻射損傷防護(hù)效應(yīng)。CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)

13、驗(yàn)結(jié)果表明給藥組較單純照射組細(xì)胞活力明顯提高，照后24小時凋亡率明顯下降。
　　(4)Zymosan-A對受照小鼠輻射敏感組織的防護(hù)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給藥照射組較單純照射組外周血白細(xì)胞數(shù)目明顯增加;骨髓有核細(xì)胞數(shù)目明顯增加，凋亡率明顯下降;照射給藥組較單純照射組其脾指數(shù)明顯增加;骨髓病理HE染色結(jié)果表明照射給藥組較單純照射組，其血竇結(jié)果破壞輕微，出血量少，藍(lán)染有核細(xì)胞明顯增加，且骨髓損傷修復(fù)速度明顯高于單純照射組。
　　5.

14、新型TLR配體Zymosan-A輻射防護(hù)初步機(jī)制探討。
　　(1)采用TLR2/4基因敲除小鼠初步驗(yàn)證Zymosan-A的輻射損傷防護(hù)機(jī)制。基因敲除小鼠生存期結(jié)果表明TLR2和TLR4基因敲除小鼠的輻射敏感性較野生型小鼠輻射敏感性增加，Zymosan-A對TLR4基因敲除小鼠發(fā)揮了明顯的輻射防護(hù)效果，而TLR2基因敲除后逆轉(zhuǎn)了Zymosan-A的輻射防護(hù)作用。
　　(2)Zymosan-A對受照小鼠體內(nèi)輻射防護(hù)細(xì)胞因子的調(diào)控

15、作用。照前給予C57BL/6小鼠Zymosan-A刺激后，照后檢測小鼠體內(nèi)輻射防護(hù)細(xì)胞因子表達(dá)水平變化，結(jié)果表明給藥組較單純照射組，小鼠體內(nèi)IL-6，IL-11，IL-12，TNF-α的水平明顯上調(diào)。
　　(3)Zymosan-A對受照小鼠造血干細(xì)胞的輻射防護(hù)作用。照前給予C57BL/6小鼠Zymosan-A刺激后，照后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠造血干細(xì)胞變化發(fā)現(xiàn)證實(shí)Zymosan-A可以促進(jìn)造血干細(xì)胞向造血祖細(xì)胞分化。
　　(

16、4)Zymosan-A對DNA損傷反應(yīng)的影響。γ-H2AX foci結(jié)果表明Zymosan-A明顯減少電離輻射后γ-H2AX foci的形成。
　　(5)RNA-SEQ方法鑒定Zymosan-A輻射防護(hù)的新效應(yīng)分子及信號通路。通過高通量二代測序共篩選出131個顯著差異基因，其中30個顯著上調(diào)基因，101個顯著下調(diào)基因，之后對顯著差異基因進(jìn)行熱圖分析，GO分析和KEGG分析，分析結(jié)果證實(shí)Zymosan-A的輻射防護(hù)作用主要通過調(diào)節(jié)照

17、后小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)進(jìn)程發(fā)揮電離輻射防護(hù)作用。
　　研究結(jié)論:
　　1.Zymosan-A對在體小鼠和體外細(xì)胞的最佳電離輻射防護(hù)劑量遠(yuǎn)低于其毒性劑量，成為潛在輻射防護(hù)劑的可能性高。
　　2.Zymosan-A對在體小鼠，輻射敏感組織和體外細(xì)胞三個層面均發(fā)揮了明顯的輻射防護(hù)作用。
　　3.通過基因敲除小鼠證實(shí)Zymosan-A主要通過靶向激活TLR2信號通路，上調(diào)輻射防護(hù)因子IL-6，IL-11，IL-12，TNF