香蘭素衍生物Dimovanin的輻射防護(hù)及作用機(jī)制研究.pdf

1、香蘭素是香莢蘭的提取物，能清除自由基，具有很好的抗氧化活性，并且能抑制X線(xiàn)誘導(dǎo)的DNA單鏈斷裂、染色體斷裂和交聯(lián)，能促進(jìn)DNA連接，以減少染色體畸變率，還能增強(qiáng)DNA修復(fù)和復(fù)制功能，具有很好的抗輻射作用，但其作用濃度高，活性低。為此軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所七室王林教授合成了一些香蘭素的衍生物(P2一P9)，期望能有更高的藥效。我們對(duì)這些衍生物進(jìn)行初步篩選，發(fā)現(xiàn)P7是較為理想的香蘭素衍生物，將其命名為Dimovanin，并對(duì)Dimovanin的

2、抗輻射作用進(jìn)行了重點(diǎn)研究，還從細(xì)胞水平、分子水平及整體水平等幾個(gè)方面探討其作用機(jī)理。 (1)輻射防護(hù)劑在保護(hù)機(jī)體免受電離輻射損害的同時(shí)，不應(yīng)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因此我們首先檢測(cè)了香蘭素各衍生物的細(xì)胞毒性。我們發(fā)現(xiàn)P6和Dimovanin在10-50gM內(nèi)對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用，隨后我們又檢測(cè)了其對(duì)2Gy輻射后腫瘤細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)的影響，發(fā)現(xiàn)P6對(duì)細(xì)胞略有增殖效應(yīng)而Dimovanin對(duì)腫瘤細(xì)胞幾乎沒(méi)有任何影響。電子自旋共振(

3、ESR)實(shí)驗(yàn)也表明Dimovanin能夠清除自由基，而且相同濃度時(shí)其作用遠(yuǎn)大于香蘭素。 (2)DNA是輻射生物學(xué)效應(yīng)的最重要靶分子，為了探討輻射后DNA損傷及Dimovanin對(duì)DNA損傷的影響，我們檢測(cè)了Dimovanin對(duì)10Gy、20Gy、50Gy60CoY射線(xiàn)照射后質(zhì)粒DNA斷裂影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒DNA經(jīng)藥物處理后DNA損傷減輕，至50gM時(shí)損傷最少，且10-50pM范圍內(nèi)呈濃度依賴(lài)關(guān)系。堿性、中性單細(xì)胞電泳檢測(cè)在體DN

4、A單鏈及雙鏈斷裂，結(jié)果表明Dimovanin可以降低DNA單、雙鏈斷裂率。免疫組化激光共聚焦及Western印跡方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Dimovanin可以降低~,-H2AX的水平而~-H2AX的形成與DSBs緊密相關(guān)，提示Dimovanin可以減輕輻射后DNA損傷，對(duì)DNA具有保護(hù)作用。 (3)電離輻射造成的DNA損傷如果不能得到及時(shí)修復(fù)或修復(fù)異常，細(xì)胞將啟動(dòng)凋亡程序。為了了解Dimovanin對(duì)輻射和細(xì)胞凋亡的影響，我們通過(guò)研究HFS

5、、L02生長(zhǎng)曲線(xiàn)及克隆形成率觀(guān)察Dimovanin對(duì)細(xì)胞的輻射保護(hù)作用，熒光雙染、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Dimovanin對(duì)輻射后細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果表明Dimovanin(5gM、lOgM、20gM、40gM)可以顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖、下調(diào)輻射后細(xì)胞凋亡率，說(shuō)明其對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)有保護(hù)作用。 (4)動(dòng)物的臟器重量、臟器系數(shù)、血清生物化學(xué)及血液學(xué)指標(biāo)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重要的生物學(xué)特征之一，是實(shí)驗(yàn)中常用的觀(guān)察指標(biāo)。特別是在輻射損傷和腫瘤放射治療研究中，

6、血液和造血系統(tǒng)的變化是非常敏感的，具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，是評(píng)價(jià)輻射損傷和確定輔照劑量的重要指標(biāo)和依據(jù)，因此，我們應(yīng)用60Coγ射線(xiàn)損傷小鼠的病理模型，從整體水平上探究了Dimovanin保護(hù)小鼠抗輻射損傷的作用。我們檢測(cè)了小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、臟器系數(shù)及并測(cè)定了血清中Cu／Zn-SOD的活性，用末端標(biāo)記法標(biāo)記脾細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微核形成率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)輻射后外周血白細(xì)胞數(shù)減少，臟器系數(shù)及血清中Cu／Zn—SOD的活性降低

7、，而Dimovanin(1mg&g、10mg／kg、100mg／kg)可增加白細(xì)胞數(shù)，臟器系數(shù)及血清中Cu／Zn-SOD的活性；輻射后脾細(xì)胞凋亡明顯，微核形成率增加，而叭movanin可以減少輻射后脾細(xì)胞凋亡率及微核形成率。同時(shí)我們對(duì)香蘭素(100mg／kg)和Dimovanin的作用做了比較，結(jié)果表明Dimovanin比香蘭素活性高。 (5)Dimovanin通過(guò)什么樣的途徑來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受電離輻射的損傷，在從分子水平是如何調(diào)控

8、細(xì)胞復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的，這對(duì)Dimovanin將來(lái)在臨床上的應(yīng)用很有意義。我們研究了Dimovanin對(duì)影響細(xì)胞凋亡和增殖的幾個(gè)信號(hào)通路的作用：DNA-PKcs／Akt／GSK3／c-myc信號(hào)通路、MAPK信號(hào)途徑及NFKB信號(hào)途徑，結(jié)果表明6~Co~射線(xiàn)抑制DNA-PKcs／Akt／GSK3／c-myc信號(hào)通路，而Dimovanin(10、20、40uM)可增加DNA-PKcs、c-myc蛋白的表達(dá)，可提高M(jìn)APK信號(hào)途徑Erk磷酸化

9、水平，降低p38的磷酸化水平，增加NFrd3的核轉(zhuǎn)錄。以上結(jié)果提示Dimovanin可能是通過(guò)這些信號(hào)通路綜合發(fā)揮作用的。 綜上所述，離體和在體實(shí)驗(yàn)均表明，Dimovanin能夠促進(jìn)正常細(xì)胞增殖，保護(hù)DNA免受輻射損傷，而且對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)增殖作用；Dimovanin在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)DNA-PKcs／Akt／GSK3／c-myc信號(hào)通路、MAPK信號(hào)途徑及NF~：B等信號(hào)途徑，參與細(xì)胞輻射損傷的修復(fù)和調(diào)控；并且香蘭素衍生物Dimovan