骨髓來源內(nèi)皮前體細(xì)胞與腫瘤新生血管的關(guān)系.pdf

1、腫瘤新生血管(Angiogenesis)與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。新生血管不僅提供腫瘤代謝所需的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，帶走代謝產(chǎn)物，維護(hù)腫瘤局部微環(huán)境穩(wěn)定，而且為腫瘤的血行轉(zhuǎn)移提供了途徑。腫瘤新生血管形成有多種途徑，但具體形成機(jī)制目前正在進(jìn)一步深入研究中。一般認(rèn)為在腫瘤快速生長(zhǎng)期，腫瘤組織內(nèi)部及周圍因缺氧等因素，內(nèi)皮細(xì)胞激活后增殖，在原有血管外圍形成內(nèi)皮細(xì)胞簇，隨著基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)等激活，在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)

2、胞生長(zhǎng)因子(B-FGF)等誘導(dǎo)下，內(nèi)皮細(xì)胞排列成管腔樣結(jié)構(gòu)，并形成基底膜，以類似出芽的方式生成腫瘤新生血管；另外，某些腫瘤細(xì)胞可以直接排列成為管道狀結(jié)構(gòu)，通過血管擬態(tài)，在腫瘤內(nèi)部形成類似血管的血流通道，提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。目前對(duì)腫瘤新生血管生成的機(jī)理研究正在進(jìn)一步深入，通過進(jìn)一步了解腫瘤新生血管形成機(jī)理，并應(yīng)用抑制腫瘤新生血管形成的方法抑制腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，對(duì)于了解腫瘤病理性血管形成機(jī)理及抗血管形成治療具有重要的意義。 干細(xì)胞

3、是指具有自身增殖能力，有多種潛在分化能力的原始細(xì)胞，在不同誘導(dǎo)條件下可以分化為不同類型的細(xì)胞。除胚胎組織富含干細(xì)胞外，出生后骨髓是干細(xì)胞的主要富集場(chǎng)所，具有多種不同分化潛能的干細(xì)胞。隨著對(duì)骨髓來源干細(xì)胞研究深入，發(fā)現(xiàn)骨髓內(nèi)有一類細(xì)胞，具有定向分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞或血細(xì)胞的潛能，這些細(xì)胞被稱為骨髓來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞(EndothelialProgenitorCells，EPCs)。EPCs具有重要的生理、病理作用。起源于小鼠胚胎期卵黃囊血島

4、中EPCs參與小鼠主動(dòng)脈弓發(fā)育、形成；出生后EPCs在女性月經(jīng)周期的子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)、1皮膚傷口愈合、缺血性組織損傷、糖尿病性視網(wǎng)膜炎、急性心肌梗塞恢復(fù)期新生血管形成等過程中均起重要作用。近來研究提示骨髓中某些細(xì)胞在腫瘤新生血管形成過程中，可以在腫瘤局部定位，進(jìn)一步成熟、分化為功能性的內(nèi)皮細(xì)胞。深入研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞表達(dá)CD31、CD133、KDR等EPCs特異性標(biāo)志，提示骨髓來源EPCs可能在腫瘤新生血管形成中起到一定作用，但也有研究提示

5、未發(fā)現(xiàn)EPCs參與腫瘤新生血管形成。 該研究首次建立了研究骨髓來源EPCs與腫瘤新生血管內(nèi)皮形成關(guān)系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究EPCs形成新生血管的機(jī)理提供了研究工具。研究中通過將正常C57BL小鼠骨髓滅活后，移植GFP轉(zhuǎn)基因C57BL熒光小鼠的骨髓，使受體小鼠骨髓來源的細(xì)胞均表達(dá)GFP，通過熒光顯微鏡可以觀察骨髓細(xì)胞在腫瘤局部定位情況。GFP熒光小鼠骨髓植入成活后，受體C57BL小鼠皮下接種C57BL小鼠來源的低分化肺腺癌細(xì)

6、胞Lewis系細(xì)胞。觀察小鼠移植腫瘤生長(zhǎng)情況，通過觀察腫瘤局部組織GFP熒光表達(dá)情況，檢測(cè)新生血管局部骨髓來源細(xì)胞定位，首先明確在腫瘤新生血管局部是否存在骨髓來源的某些細(xì)胞；觀察到骨髓來源細(xì)胞在腫瘤新生血管定位后，進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤新生血管定位的骨髓細(xì)胞性質(zhì)，通過間接免疫熒光法及免疫組化法檢測(cè)腫瘤局部新生血管內(nèi)皮CD31、CD34、CD133、VE-Cadherin、KDR等EPCs標(biāo)志表達(dá)，明確參與腫瘤新生血管內(nèi)皮形成的骨髓來源細(xì)胞是否為

7、EPCs；通過流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)同時(shí)表達(dá)骨髓GFP(綠色熒光)以及CD31、CD133(間接免疫熒光標(biāo)記紅色熒光)陽(yáng)性的熒光細(xì)胞，了解EPCs分化來源與通過腫瘤周圍血管內(nèi)皮出芽形成在腫瘤新生血管內(nèi)皮的大致比例；為明確VEGF、細(xì)胞間粘附分子(ICAM)與EPCs在腫瘤局部新生血管的作用，ELISA法檢測(cè)血清VEGF、ICAM水平，研究VEGF、ICAM與內(nèi)皮前體細(xì)胞在腫瘤新生血管定位的相關(guān)性；為觀察Endostatin、

8、SU-5416(VEGFR-2特異性酪氨酸蛋白激酶抑制劑)等腫瘤新生血管抑制劑對(duì)內(nèi)皮前體細(xì)胞在腫瘤局部定位的影響，通過尾靜脈注射藥物后觀察腫瘤生長(zhǎng)及EPCs在腫瘤組織局部定位、增殖情況；用WesternBlot檢測(cè)腫瘤組織VE-Cadherin，KDR蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)上述藥物對(duì)腫瘤新生血管的內(nèi)皮特異性標(biāo)志表達(dá)的影響。 通過該研究，首先成功建立了骨髓移植小鼠的腫瘤移植模型，為下一步研究EPCs與腫瘤新生血管的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。骨髓

9、完全滅活的小鼠接受GFP轉(zhuǎn)基因熒光小鼠骨髓后，2周內(nèi)骨髓植活，在小鼠骨髓中可以觀察到骨髓細(xì)胞均表達(dá)供體來源的GFP熒光。熒光顯微鏡觀察到腫瘤新生血管局部有表達(dá)GFP的骨髓來源細(xì)胞，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)部分骨髓來源的細(xì)胞為CD31、CD34、CD133、陽(yáng)性的EPCs；間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)也觀察到腫瘤新生血管局部有同時(shí)表達(dá)GFP的綠色熒光以及CD133、CD31、KDR的紅色熒光，證明這些骨髓來源細(xì)胞具有EPCs特異性的細(xì)胞表面標(biāo)志；FCM檢

10、測(cè)GFP熒光的骨髓細(xì)胞以及TRITIC標(biāo)記的CD31、CD133陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該研究模型中，腫瘤組織內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞部分通過出芽等方式來源于原有血管的內(nèi)皮細(xì)胞，還有約35％來源于骨髓來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞，腫瘤新生血管過程中，有多種血管形成機(jī)制參與；通過EIA法，檢測(cè)小鼠腫瘤快速生長(zhǎng)期血清VEGF、ICAM水平，結(jié)果提示在腫瘤快速生長(zhǎng)期，VEGF、ICAM均明顯升高，與骨髓來源EPCs的動(dòng)員、在腫瘤新生血管局部定位相關(guān)；VEGF、B-F

11、GF促進(jìn)骨髓來源EPCs在腫瘤新生血管定位，并進(jìn)一步分化成熟為功能性內(nèi)皮細(xì)胞；而腫瘤新生血管抑制因子Endostatin、SU-5416抑制骨髓內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤新生血管定位，抑制腫瘤新生血管的形成，腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢；通過WesternBlot檢測(cè)腫瘤局部VE-Cadherin、KDR表達(dá)水平，提示B-FGF、VEGF均促進(jìn)VE-Cadherin、KDR表達(dá)，與Endostatin、SU-5416可抑制VE-Cadherin、KDR表達(dá)。

12、 通過該研究，首先建立了EPCs參與形成腫瘤新生血管的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，有助于以后類似研究開展。傳統(tǒng)觀念的腫瘤新生血管形成一般使在原有腫瘤周圍血管在缺氧等條件下，腫瘤組織分泌VEGF、B-FGF等促血管生長(zhǎng)因子，原有血管內(nèi)皮細(xì)胞激活，并進(jìn)一步增殖，遷移到腫瘤組織，形成腫瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞。該研究在前人研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證明骨髓來源的細(xì)胞參與了腫瘤新生血管形成，骨髓來源EPCs與腫瘤生長(zhǎng)及新生血管形成密切相關(guān)，腫瘤局部新生血管內(nèi)皮部分

13、來源于骨髓EPCs，證實(shí)了腫瘤新生血管形成的一種新的機(jī)理；影響EPCs形成腫瘤新生血管內(nèi)皮過程中，VEGF與B-FGF促進(jìn)EPCs在腫瘤局部定位，增殖，并進(jìn)一步分化為功能型內(nèi)皮細(xì)胞，在血管形成的病理過程中起了重要作用；而SU-5416、Endostatin均可抑制EPCs參與的腫瘤新生血管形成。SU-5416是一種抑制內(nèi)皮VEGFR-2酪氨酸蛋白激酶(TPK)的喹啉類小分子化合物，特異性阻斷VEGFR2特異性的TPK活性，SU5416抑

14、制EPCs參與形成腫瘤新生血管形成，提示在EPCs激活過程中，VEGFR2激活后的酪氨酸磷酸化等后續(xù)步驟在EPCS激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起到重要作用；Endostatin抑制EPC形成新生血管的具體機(jī)理目前還存在爭(zhēng)論，一般認(rèn)為其可誘導(dǎo)EPCs凋亡，阻斷EPCs分化成熟過程。 該研究通過對(duì)EPCs參與腫瘤新生血管形成的研究，豐富了腫瘤新生血管形成的機(jī)理，證實(shí)EPCs在腫瘤新生血管局部定位、增殖、分化，進(jìn)一步分化為功能型內(nèi)皮細(xì)胞