高選擇性識別半胱氨酸的雙光子熒光探針及其在活細胞成像中的應用.pdf

1、繼生物光學顯微鏡、普適性生物熒光顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡之后，雙光子熒光顯微鏡已經(jīng)成為新一代的細胞和組織的微觀成像工具。與傳統(tǒng)的單光子熒光共聚焦顯微鏡相比，雙光子熒光顯微鏡在成像細胞和組織方面顯示出了許多顯著的優(yōu)勢:紅外激發(fā)、生物樣品穿透深度大、自發(fā)熒光低、生物樣品的光損傷小、明顯延長活細胞和組織的觀測時間等。特別地，雙光子熒光顯微鏡在對活性生物樣品的觀測上體現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢，這使得生物科學家們得以在活的細胞和組織中觀察和研究生命過程。

2、熒光顯微探測技術與熒光探針是相互依存互相促進的，新的熒光技術需要新的探針，新的探針將使探測技術更加完善。雙光子熒光探針的研究是隨著雙光子熒光顯微鏡的出現(xiàn)而逐漸發(fā)展起來的，但其研究工作的相對滯后則限制了它們在雙光子熒光顯微鏡上的廣泛應用。因此，發(fā)展具有大活性吸收截面的、高熒光量子產(chǎn)率的雙光子熒光探針具有非常重要的科學價值和研究意義。目前已有很多種特定用途的雙光子熒光探針報道。這些探針主要有雙光子核酸探針、雙光子離子探針、雙光子pH探針、雙

3、光子脂質(zhì)筏探針以及雙光子半胱氮酸/高半胱氨酸探針等。
　　 半胱氨酸(Cysteine，Cys)和高半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)在細胞抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵的作用。Cys和Hcy同時表達在真核細胞內(nèi)，其分子結構上只有一個亞甲基的差別，但功能重要卻完全不同:Cys是構成蛋白質(zhì)和谷胱甘肽的氨基酸;Hcy與人類的心血管疾病、進行性老年癡呆癥有直接關聯(lián)。針對目前高選擇性識別并成像細胞內(nèi)Cys及Hcy的熒光探針尚不成熟、識

4、別并成像細胞內(nèi)Hcy的熒光探針尚無報道、高選擇性識別并利用雙光子熒光顯微鏡成像細胞內(nèi)Cys的雙光子熒光探針剛剛起步的狀態(tài)，開展具有活細胞通透性的高選擇性識別Cys或Hcy的雙光子熒光探針的研究是非常重要的。本文成功設計并合成了能夠高選擇性識別Cys的雙光子熒光探針并利用雙光子熒光顯微鏡實現(xiàn)了其在活細胞中的熒光成像。
　　 本文利用Vilsmeier反應和Heck反應等有機化學反應，以三苯胺和咔唑為母體，我們成功地制備了一系列能夠

5、選擇性識別Cys的雙光子生物熒光探針，并通過核磁共振譜，元素分析，紅外及質(zhì)譜等手段對目標探針分子進行了結構表征。這類探針分子的合成路線簡單，易于操作。這些探針分子分別用AM1、CA1、CA2、CA3、ZA1和ZA2來表示。其中，CA2和CA3與CA1表現(xiàn)出了相似的性質(zhì)，本論文著重討論AM1、CA1、ZA1和ZA2的合成和性質(zhì)。
　　 在大量實驗研究中發(fā)現(xiàn):AM1與CA1是對檢測Cys具有高選擇性的雙光子熒光探針，分別發(fā)射紅光與綠

6、光，并且它們能夠在活細胞中對Cys進行雙光子熒光顯微成像。AM1與CA1本身不具有雙光子熒光性能，與Cys結合后，AM1+Cys在920nm激發(fā)下的雙光子吸收截面則高達1700GM(1GM=10-50cm4sphoton-1)，而CA1+Cys在810nm激發(fā)下的雙光子吸收截面為90GM，其作用環(huán)境分別是乙腈-Tris/HCl(v/v，4∶1，tris:10mM，KCl:100mM，pH=7.27)混合溶液和甲醇-Tris/HCl(v/

7、v，4∶1，Tris:10mM，KCl:100mM，pH=7.00)混合溶液。特別地，在雙光子800nm激發(fā)下，AM1+Cys的雙光子熒光強度分別是AM1+NAC(N-乙?；腚装彼?，AM1+Hcy和AM1的11倍、67倍和60倍，而CA1+Cys的雙光子熒光強度分別是CA1+NAC，CA1+Hcy和CA1的2.64倍、77倍和59倍。為了進一步考察AM1和CA1與Cys之間的相互作用，我們對AM1和CA1與Cys進行了紫外吸收、單光

8、子熒光、雙光子熒光光譜滴定實驗。其結果表明，當Cys與AM1或CA1之間的摩爾比小于30時，探針的光物理性質(zhì)沒有明顯的改變，當摩爾比在30-60之間時，吸光度，單、雙光子熒光強度迅速增強，當摩爾比大于60時，這些光物理性質(zhì)均保持穩(wěn)定;AM1和CA1對Cys的檢測極限大約在293-408μM。同時關于探針AM1和CA1的選擇性我們還做了詳細的實驗分析，發(fā)現(xiàn)只有在加入Cys的情況下，探針的吸光度與單、雙光子熒光強度發(fā)生顯著的變化，并伴隨明顯

9、的溶液顏色變化。因此，AM1和CA1既是對Cys具有高選擇性識別性能的光開關型(turn-on)雙光子熒光探針，又可以作為檢測Cys的裸眼探針。我們還研究了生理范圍內(nèi)pH值的變化對AM1和CA1熒光強度的影響:在pH=4-7.5范圍內(nèi)，pH值的變化對AM1和CA1熒光性能的影響很小且可以忽略，進而認為它們在生物細胞中的應用不會受到生理環(huán)境中pH變化的影響。另外，我們還對AM1和CA1與Cys作用的機理進行了詳細的探討。
　　 與

10、AM1和CA1相比，ZA1和ZA2是能夠?qū)Ｒ蛔R別Cys的單光子熒光探針。ZA1和ZA2本身沒有熒光，當它們與Cys結合后發(fā)射較強的藍色熒光，其熒光強度分別增強105倍和200倍，而當加入其它生物分析物后，探針的紫外吸收光譜和熒光光譜并沒有明顯改變。另外，我們還實現(xiàn)了ZA1和ZA2在活細胞中對Cys的寬場成像。
　　 綜上，本文成功地設計并合成了一系列具有高選擇性的Cys熒光探針，并且發(fā)射了紅、綠、藍三種顏色的熒光。特別地，AM1