基于苯并噻唑（咪唑）的膜通透性雙光子生物熒光染料的設(shè)計(jì)、合成及其在細(xì)胞成像中的應(yīng)用.pdf

1、熒光標(biāo)記方法是最有效、快捷的生物標(biāo)記方法之一，起源于20世紀(jì)40年代，最早被用于熒光標(biāo)記抗體來檢測相應(yīng)的抗原。隨著生命科學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展和各種先進(jìn)熒光檢測儀器及技術(shù)的應(yīng)用，非放射性的熒光標(biāo)記作因其操作簡便、穩(wěn)定性高、靈敏度高和選擇性高等特點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注，并取得迅速發(fā)展。隨著生物顯微成像技術(shù)的發(fā)展，雙光子熒光顯微鏡已經(jīng)成為新一代細(xì)胞或組織顯微成像的工具。雙光子顯微鏡的發(fā)展已經(jīng)徹底改變了在活性細(xì)胞和組織（特別是厚的或高散射的標(biāo)本）觀測中的

2、問題。與單光子激光共聚焦顯微鏡相比，雙光子顯微鏡具有諸如近紅外光激發(fā)、避免熒光漂白和光致毒、高分辨率、減小組織對激發(fā)光的吸收及降低組織自發(fā)熒光干擾等特點(diǎn)。但是，如果所用熒光染料的雙光子吸收截面小（與生物樣品的內(nèi)源性發(fā)光物質(zhì)相近），那么雙光子顯微鏡優(yōu)勢會被大打折扣。由于理論上單、雙光子吸收服從不同的選律，所以優(yōu)秀的單光子熒光生物染料不一定具備大的雙光子活性熒光截面。目前用于激光共聚焦顯微鏡的單光子熒光生物染料幾乎都不具備大的雙光子熒光活性

3、吸收截面，這限制了雙光子熒光顯微鏡的應(yīng)用推廣。因而，開發(fā)優(yōu)良的雙子熒光生物染料的研究成為一個(gè)熱門課題。本論文以分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、生物科學(xué)與染料化學(xué)的交叉為立足點(diǎn)，從分子結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新入手，設(shè)計(jì)合成一系列含有苯并噻唑或苯并咪唑的新型染料分子，為熒光生物染料在雙光子熒光成像中出現(xiàn)的瓶頸問題提供解決方案。圍繞著這個(gè)目的，本論文主要開展了以下工作:
　　(1)設(shè)計(jì)、合成了一系列新穎的膜通透性雙光子熒光染料BTVPA、BIVPA、BTPA、B

4、IPA、BTVCZ、BIVCZ和BTCZ，并進(jìn)行了詳盡的光物理性質(zhì)的測試、細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)和初步應(yīng)用的探討。與經(jīng)典的香豆素、熒光素和羅丹明類染料相比，BTVPA、BIVPA、BTPA、BIPA、BTVCZ、BIVCZ和BTCZ具有顯著的優(yōu)點(diǎn):其雙光子吸收截面遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于以上三大經(jīng)典染料，而且保留了這些經(jīng)典染料的膜通透性。BTVPA染料具有多個(gè)改造位點(diǎn)，可以通過連接靶向基團(tuán)進(jìn)行雙光子探針的改造。本研究中，我們在BTVPA染料平臺基礎(chǔ)上構(gòu)建了雙光子

5、核酸探針BTVPA-nucleic acid，雙光子熒光成像表明:探針BTVPA-nucleic acid能夠高質(zhì)量的標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核。
　　(2)設(shè)計(jì)、合成了六個(gè)RNA探針DHTI、DMTI、DMI、IMT-E、IMT-M和 IMI。體外熒光滴定實(shí)驗(yàn)證明六個(gè)探針對RNA具有較高的選擇性和靈敏的光開關(guān)性能;單光子、雙光子生物熒光成像表明六個(gè)探針均能獲得細(xì)胞內(nèi)核仁和細(xì)胞質(zhì)中RNA清晰的熒光成像圖片，具有優(yōu)秀的膜通透性和內(nèi)源性RNA

6、的選擇性。RNA消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了這六個(gè)探針可以優(yōu)先選著細(xì)胞內(nèi)源性的RNA，當(dāng)RNA被水解之后，才能與細(xì)胞內(nèi)源性的DNA相結(jié)合;核仁的形態(tài)、大小和數(shù)量與細(xì)胞的惡變息息相關(guān)，通過利用紅發(fā)射的雙光子RNA探針DHTI或DMTI與Hoechst33342在活性或固定HeLa細(xì)胞的寬場、激光共聚焦和雙光子共染熒光成像圖片。我們不僅能夠清晰的能觀察出核仁的大小、數(shù)量和形態(tài)，還可以觀察細(xì)胞核和胞質(zhì)的輪廓，這些形態(tài)信息可能為科研工作者對癌癥的診斷提

7、供參考依據(jù)。
　　(3)由于線粒體的動(dòng)態(tài)變化多數(shù)都是由DNA參與而引起的，所以線粒體DNA探針將對給科研研究提供重要的支持，本論文設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)紅光發(fā)射的雙光子線粒體DNA探針DMT-M和DMT-E。體外熒光滴定實(shí)驗(yàn)證明了對DNA具有靈敏的光開關(guān)性能;用單光子共聚焦和雙光子顯微鏡獲得了清晰的熒光成像花絲狀線粒體的圖片，表明這兩個(gè)探針高的線粒體選擇性和優(yōu)秀的膜通透性;DNA消化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了探針DMT-M和DMT-E線粒體DNA的

8、選擇性，當(dāng)DNA被水解之后，熒光強(qiáng)度明顯降低;通過與SYTO S-11348與DMT-M或DMT-E的共染實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了這兩個(gè)探針優(yōu)秀的細(xì)胞膜通透性和可以進(jìn)行健康的活細(xì)胞染色;光穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)證明了探針具有可持續(xù)追蹤觀察線粒體形態(tài)變化的潛質(zhì)。
　　(4)針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具備磷脂分子層膜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，在膜探針的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成雙光子紅光發(fā)射的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針MDT。用單光子共聚焦和雙光子顯微鏡，獲得了清晰的熒光成像網(wǎng)狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的圖片，說明了此探針高的

9、線粒體選擇性和優(yōu)秀的膜通透性;MTT實(shí)驗(yàn)證明了探針的低毒性和生物相容性;由于固定細(xì)胞的線粒體不具備膜電位，用固定細(xì)胞的單、雙光子成像實(shí)驗(yàn)排除陽離子型探針MDT對細(xì)胞內(nèi)線粒體的干擾。此研究能夠?yàn)橐阅ぐ邢虻膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)探針提供設(shè)計(jì)思路。
　　總之，在本論文中設(shè)計(jì)合成了一系列膜通透性的雙光子染料平臺、RNA探針、線粒體DNA探針，詳細(xì)的研究了這些熒光染料的雙光子性能。這些染料平臺的雙光子吸收截面遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于經(jīng)典羅丹明、香豆素和熒光素染料，并且保留

10、了經(jīng)典生物染料的膜通透性。本文也重點(diǎn)對這六種RNA探針與RNA的識別機(jī)理進(jìn)行了詳細(xì)的探討，并首次提出了利用紅光發(fā)射的雙光子RNA探針DHTI與DMTI與Hoechst33342在活性或固定HeLa細(xì)胞的寬場、激光共聚焦和雙光子顯微鏡下的共染熒光成像圖片來觀測核仁的大小、數(shù)量、形態(tài)和細(xì)胞核或胞質(zhì)的輪廓，這可能對惡性腫瘤細(xì)胞的檢測提供參考依據(jù)。另外，利用調(diào)解陽離子鹽與DNA的結(jié)合能力，設(shè)計(jì)合成了線粒體DNA探針DMT-M和DMT-E，可以長