常用實驗動物帶血管蒂全卵巢冷凍保存方法初探.pdf

1、目的：
　　隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，逐步完善的放化療技術(shù)使癌癥患者的治愈率在逐年上升，但放化療技術(shù)在打擊癌癥細(xì)胞的同時，也對女性卵巢造成了不可逆的損傷，甚至引起卵巢功能早衰及不育。但對于年輕女性癌癥患者而言，她們不僅希望延續(xù)生命，更希望獲得患癌后的高品質(zhì)生活。因此，保護(hù)高治愈率女性癌癥患者卵巢功能成為癌癥治療過程中不可分割的一道程序，其方法包括卵子冷凍、胚胎冷凍和卵巢冷凍，而帶血管蒂全卵巢冷凍保存及移植是未來的一個發(fā)展方向。目前，臨床

2、上已有報道新鮮全卵巢移植成功的案例，但經(jīng)冷凍后全卵巢的移植仍處于實驗階段，主要是冷凍保存技術(shù)方面的困難和移植卵巢血管再吻合的可行性。對此，很有必要進(jìn)行大量的動物實驗研究來建立和完善全卵巢冷凍保存技術(shù)。鑒于兔、豚鼠和大鼠都是最常用的實驗動物，我們采用獨創(chuàng)的已獲專利授權(quán)的灌注針、灌注技術(shù)和經(jīng)典的程序化冷凍方案，對成年兔、豚鼠和大鼠的帶血管蒂全卵巢進(jìn)行灌注和冷凍保存，研究可調(diào)節(jié)灌注針能否運用于不同體型動物卵巢血管的灌注以及相同的灌注壓力和速率

3、對不同體積卵巢的影響如何，為將來人全卵巢冷凍保存及移植的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　首先進(jìn)行大鼠全卵巢明膠墨汁的灌注實驗，驗證灌注模型的建立。再分別取6只性成熟雌性中國大耳白兔、6只Dunkan-Hartley系豚鼠、6只SD大鼠各12個帶血管蒂全卵巢進(jìn)行實驗。每種動物均分為四組。①新鮮組:離體后的帶血管蒂全卵巢;②肝素組:將取下的卵巢立即放置于含4℃取材液直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下，用麥管制作的灌注針插入卵

4、巢動脈，連接延長管和微泵，以1.0ml/min的速度灌注肝素鈉生理鹽水，直至靜脈流出清澈液體;③毒性組:卵巢經(jīng)肝素鈉生理鹽水灌注后，繼續(xù)灌注冷凍保護(hù)劑，持續(xù)15min，再將其放置于含冷凍保護(hù)劑的1.8ml冷凍管中平衡15min;④冷凍組:在毒性組的基礎(chǔ)上，將卵巢進(jìn)行程序化冷凍，液氮中至少保存1周后再進(jìn)行解凍。
　　將每個卵巢分成2部分，處理如下:①4％多聚甲醛固定，24h后石蠟包埋、切片、HE染色，再在光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，免疫組

5、化檢測各組卵巢中PCNA的表達(dá)情況;②-80℃冰箱儲存，一部分進(jìn)行MDA、SOD、GSH的測定，檢驗實驗過程是否引起了組織內(nèi)部氧化-抗氧化平衡的失調(diào)，另一部分做Western blot分析，檢測三種動物的各組卵巢中凋亡的情況。血管分成上（遠(yuǎn)卵巢端）、中（中段血管）、下（近卵巢端）三部分分別固定于4％多聚甲醛，24h后石蠟包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下分別觀察兔、豚鼠和大鼠三種動物各組的上、中、下三部分血管是否有損傷。
　　結(jié)

6、果：
　　1.大鼠全卵巢墨汁灌注模型的建立
　　經(jīng)3％明膠墨汁灌注后，HE染色的結(jié)果顯示，明膠墨汁進(jìn)入卵巢動脈后均勻分布于卵巢脈管系統(tǒng)，證實大鼠全卵巢墨汁灌注模型的成功建立。
　　2.灌注及冷凍過程對兔、豚鼠、大鼠卵巢組織及血管組織的形態(tài)學(xué)影響
　　計數(shù)各組切片中形態(tài)正常的原始卵泡比例，結(jié)果顯示三種動物卵巢的各自肝素組、毒性組及冷凍組與新鮮組之間橫向比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，再對三種動物的新鮮組、肝素

7、組、毒性組以及冷凍組進(jìn)行縱向比較，發(fā)現(xiàn)它們之間也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;血管損傷主要是在上部（遠(yuǎn)卵巢端），三種動物近卵巢端的各組動靜脈均未見明顯損傷。
　　3.免疫組化檢測PCNA在兔、豚鼠、大鼠三種動物卵巢組織中的表達(dá)
　　在兔、豚鼠、大鼠卵巢的新鮮組和冷凍組中均可見PCNA表達(dá)，而且在三種動物的新鮮組和冷凍組中的表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05)。陰性對照組（用等量的PBS替代一抗）未觀察到PCNA的表達(dá)。
　

8、　4.MDA、SOD、GSH的測定
　　對三種動物卵巢的各組分別進(jìn)行了GSH、MDA、SOD的測定，結(jié)果顯示，與各自的新鮮組相比，肝素組和毒性組抗氧化指標(biāo)未見顯著性差異，但是新鮮組與冷凍組之間存在顯著性差異，P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.Western blot方法檢測凋亡相關(guān)基因Caspase3和Bax在蛋白水平的表達(dá)
　　在兔卵巢的新鮮組、肝素組、毒性組及冷凍組中，各組Caspase3蛋白的表達(dá)量差別無統(tǒng)計

9、學(xué)意義(P＞0.05)，Bax蛋白在各組之間的表達(dá)同樣無顯著性差異（P＞0.05）;在豚鼠卵巢中，Caspase3蛋白的表達(dá)在新鮮組和冷凍組、肝素組和冷凍組之間存在顯著性差異(P＜0.05);在大鼠卵巢中，Caspase3蛋白的表達(dá)顯示，新鮮組與其他各組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而Bax蛋白的表達(dá)僅在新鮮組和冷凍組之間有顯著性差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.以大鼠為模型的帶血管蒂全卵巢墨汁灌注再次

10、證明了本專利（麥管針）的實用性，可以通過調(diào)節(jié)麥管針的粗細(xì)來灌注大小不同的動物器官;
　　2.本實驗結(jié)果初步證實了相同的灌注壓力(60mmHg)和灌注速率(1ml/min)同時適用于不同體積的兔、豚鼠和大鼠卵巢;
　　3.通過灌注、冷凍、解凍這一系列過程，在兔、豚鼠和大鼠卵巢的初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡的顆粒細(xì)胞核和卵母細(xì)胞核中仍可觀察到PCNA的表達(dá)，且在冷凍組卵泡中的表達(dá)率與新鮮組之間無明顯差異(P＞0.05);
　

11、　4.以L-15+1.5mol/L DMSO+10％ FBS為冷凍保護(hù)劑進(jìn)行的程序化冷凍，從形態(tài)學(xué)上觀察，對兔、豚鼠及大鼠卵巢未造成明顯的損壞，但從MDA、SOD和GSH的檢測中觀察到冷凍過程導(dǎo)致三種動物卵巢氧化-抗氧化平衡的失調(diào);
　　5.從蛋白質(zhì)水平檢測說明，兔的新鮮組、肝素組、毒性組、冷凍組之間Caspase3的表達(dá)和Bax的表達(dá)無顯著性差異，說明冷凍過程未引起兔卵巢明顯的細(xì)胞凋亡;在豚鼠冷凍組中Caspase3的表達(dá)明顯高