根癌農(nóng)桿菌拮抗真菌的篩選、發(fā)酵及有機(jī)錫新化合物抗TMV、抗癌機(jī)制研究.pdf

1、本文分為兩個(gè)部分。第一部分是針對(duì)目前根癌病的生防細(xì)菌不耐旱，壽命短的缺點(diǎn)，首次從果樹(shù)根系土壤中篩選拮抗根癌農(nóng)桿菌的生防真菌，并確定生防真菌的發(fā)酵條件，為植物根癌病生防菌株的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用擴(kuò)大菌種資源；另一部分是針對(duì)目前防止TMV的一般藥劑很難在不傷害寄主的情況下抑制病毒增殖，首次對(duì)南開(kāi)大學(xué)李正名院士提供的有機(jī)錫新化合物04-W0319進(jìn)行了抗TMV活性及機(jī)制的研究，并在此基礎(chǔ)上對(duì)04-W0319的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為開(kāi)發(fā)低毒、高效的

2、有機(jī)錫新化合物，拓展其應(yīng)用范圍提供參考依據(jù)。在第一部分的研究中，從我國(guó)12個(gè)省市采集的土樣中分離純化出152株真菌，采用瓊脂柱初篩，得到2株抗根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens T-37(簡(jiǎn)稱 T-37)的真菌菌株，通過(guò)濾紙片法進(jìn)行對(duì)比復(fù)篩，證實(shí)了此2株菌株對(duì)根癌農(nóng)桿菌具有拮抗作用。根據(jù)Raper (1965)關(guān)于曲霉屬的分類標(biāo)準(zhǔn)，拮抗1號(hào)真菌菌株的主要形態(tài)特征與他所描述的黑曲霉(Aspergillus nig

3、er V.Tieghen 1867)的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)基本相同，鑒定該菌株屬于曲霉屬黑曲霉群的一株黑曲霉，記為黑曲霉xj (Aspergillus niger xj)，并將該菌種保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。根據(jù)Brown & Smith(1957)的分類標(biāo)準(zhǔn)，拮抗2號(hào)菌株鑒定為輪枝擬青霉，記為輪枝擬青霉49-01 (Paecilomyces verticillatus 49-01)，為新種。對(duì)xj菌株進(jìn)行單孢子分離，獲得8個(gè)單孢子株，分別記為

4、xj-1、xj-2、xj-3、xj-4、xj-5、xj-6、xj-7、xj-8。通過(guò)對(duì)菌落生長(zhǎng)情況，產(chǎn)孢量、分生孢子的萌發(fā)率、對(duì)T-37抑制活性的綜合比較，認(rèn)為xj-5為優(yōu)勢(shì)單孢子株，并對(duì)其繼代培養(yǎng)后的培養(yǎng)性狀及對(duì)T-37的抑制活性進(jìn)行了考察，xj-5單孢子株所表現(xiàn)出的遺傳性狀較為穩(wěn)定并且所產(chǎn)生的抑菌圈直徑(20.13±0.09 mm)高于對(duì)照xj菌株(18.28±0.21 mm)。以xj-5單孢子株作為出發(fā)菌株，對(duì)其發(fā)酵工藝條件進(jìn)行探

5、索。對(duì)培養(yǎng)成分中2％的麥芽糖、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、甘油6種碳源和3％的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、氯化銨、脲素6種氮源進(jìn)行單因素篩選，選擇麥芽糖、蔗糖為碳源，酵母膏、蛋白胨為氮源，并設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)C／N進(jìn)行優(yōu)化。確定xj-5菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：麥芽糖2％，蔗糖2％，酵母膏3％，蛋白胨1％。對(duì)培養(yǎng)條件中的不同接種量、裝液量、培養(yǎng)溫度及發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH值分別進(jìn)行了篩選。確定xj-5菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：接種15％

6、、搖瓶裝液量10％、培養(yǎng)溫度25℃、發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH自然。根據(jù)以上篩選出的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，將xj-5菌株接種搖瓶培養(yǎng)，每隔24h定時(shí)取樣，測(cè)定生物量和抑菌圈直徑，繪制發(fā)酵動(dòng)態(tài)曲線。結(jié)果顯示：xj-5菌株直接進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，無(wú)生長(zhǎng)延遲期，這可能是因?yàn)榧尤氲囊后w母種活力強(qiáng)，并且培養(yǎng)條件的差異不大，菌株能很快適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，直接進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，并且這段時(shí)間較長(zhǎng)(1-8d)，生物量在第8天的時(shí)候達(dá)到了最大(161.24g／L)，同時(shí)抑菌成

7、分也在不斷分泌與積累。隨后延遲期(9-12d)持續(xù)了較長(zhǎng)的時(shí)間，并在當(dāng)在第10天的時(shí)候，代謝產(chǎn)物的累積達(dá)到了高峰，抑菌圈直徑達(dá)到最大(54.48 mm)。隨著發(fā)酵培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的耗盡，衰老期的出現(xiàn)(13-15d)，毒素的累積及菌體自溶導(dǎo)致生物量急劇下降，而細(xì)胞內(nèi)容物的流出和細(xì)胞碎片的產(chǎn)生導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)基pH值的變化，直接影響著xj菌株的抑菌成分的活性，以致抑菌圈直徑也急劇下降。因此，根據(jù)xj-5菌株的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的模型，確立xj-5菌株抑菌活性

8、成分的發(fā)酵工藝為：制備麥芽糖2％，蔗糖2％，酵母膏3％，蛋白胨1％，pH自然的發(fā)酵培養(yǎng)基，將xj-5菌株按15％的接種量，接種到裝液量為10％的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃，120rpm，搖瓶培養(yǎng)10d，收集菌絲體制備發(fā)酵濃縮液，濾紙片法測(cè)xj-5菌株的抑菌圈直徑達(dá)54.48 mm。 第二部分的研究以心葉煙為材料，得到有機(jī)錫新化合物04-W0319對(duì)煙草花葉病毒侵染的治療效果為49.38％；鈍化效果為73.23％；保護(hù)效果為48.8

9、2％。 500μg/L 04-W0319與TMV體外作用30min，電鏡下觀察，顯示病毒粒體出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，粒體結(jié)構(gòu)受到了破壞；瓊脂糖凝膠電泳顯示04-W0319對(duì)TMV-RNA具有體外降解作用；TMV-CP的UV測(cè)定結(jié)果反映了04-W0319對(duì)煙草花葉病毒的體外聚合過(guò)程具有抑制作用。對(duì)普通煙K326的PAL、POD和SOD的活性進(jìn)行了測(cè)定。PAL活性測(cè)定結(jié)果表明：500μg/L 04-W0319處理的煙苗在第7天達(dá)到酶活高峰值，第9天降

10、到最低，并且煙草在接種TMV后再用04-W0319處理可使酶活性增加。POD活性測(cè)定結(jié)果表明：?jiǎn)为?dú)用04-W0319處理的酶活在第7天達(dá)到酶活高峰值，煙草在接種TMV后再用04-W0319處理也可使酶活性增加，在第9天達(dá)到酶活高峰值，并高于其它處理。SOD活性測(cè)定結(jié)果表明：TMV處理的酶活于第5天達(dá)到一個(gè)高峰值，隨后酶活在第9天又達(dá)到另一個(gè)高峰值，接種TMV后再用04-W0319處理的與發(fā)病對(duì)照的酶活趨勢(shì)一致，單獨(dú)用0-W0319處理的

11、煙苗酶活在第5天達(dá)到高峰值，并高于其它處理組。 K326的胞間蛋白經(jīng)SDS-PAGE不連續(xù)電泳分析表明：化合物04-W0319對(duì)K326的胞間蛋白影響不大，并且對(duì)PR蛋白的誘導(dǎo)也不強(qiáng)。 04-W0319對(duì)寄主葉綠素含量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TMV感染后使得煙草葉片中葉綠素的含量大大降低，04-W0319處理的煙草葉片葉綠素含量有所提高，說(shuō)明04-W0319能夠減少病毒對(duì)煙草葉片中葉綠體的破壞作用，增加了葉綠素的含量，從而提高寄主的抗病性；

12、但藥劑處理煙草葉片的葉綠素含量仍然低于健康對(duì)照，這也說(shuō)明04-W0319不能完全抑制病毒對(duì)葉綠素的破壞作用。因此，04-W0319一方面可在體外與TMV作用，降低TMV的侵染率；另一方面可提高寄主防御酶系活性和增加葉綠素含量，提高寄主抗性，抵御TMV的侵染。以PC3、Bcap-37和BGC823腫瘤細(xì)胞為材料，04-W0319作用72h對(duì)PC3細(xì)胞的IC50為0.13 μg／mL：作用48h對(duì)Bcap-37細(xì)胞的IC50為0.18pg／

13、mL：作用48h對(duì)BGC823細(xì)胞的IC50為0.17 μg／mL。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)初步判斷：04-W0319誘導(dǎo)3株細(xì)胞死亡主要不是通過(guò)細(xì)胞毒性。劃痕標(biāo)記法實(shí)驗(yàn)表明04-W0319可降低3株細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH活力測(cè)定表明：72h內(nèi)凋亡始終是04-W0319誘導(dǎo)PC3和Bcap-37細(xì)胞死亡采用的主要方式；48 h內(nèi)凋亡始終是04-W0319誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞死亡采用的主要方式。流式

14、細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步揭示：0.15 μg/mL 04-W0319作用48h，將PC3或Bcap-37細(xì)胞阻滯在G2／M期而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖；當(dāng)作用時(shí)間延長(zhǎng)或作用濃度增高時(shí)，以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡為主；對(duì)BGC823細(xì)胞，0.15 μg／mL 04-W0319作用48h，將細(xì)胞阻滯在G0／G1期，并伴隨誘導(dǎo)凋亡而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖；但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，04-W0319將BGC823細(xì)胞周期阻斷在G2／M期，并伴隨著細(xì)胞發(fā)生壞死。免