切應力調控內皮祖細胞功能的基礎和臨床應用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化所造成的冠狀動脈和外周血管疾病是嚴重危害人類健康的主要原因。血管內皮結構和功能損傷是動脈粥樣硬化血管疾病的始動環(huán)節(jié)，修復血管內皮損傷是防治動脈粥樣硬化血管疾病的重要措施。近來研究表明，骨髓、外周血和臍血中存在內皮細胞的前體細胞．內皮祖細胞(Endothelial progenitorcells，EPCs)。與成熟的內皮細胞相比，內皮祖細胞具有以下特點：(1)原位分化增殖能力極強；(2)粘附和貼壁能力強；(3)體外擴增培養(yǎng)速度

2、快，且容易獲得。內皮祖細胞能加快損傷血管再內皮化，抑制病理性新生內膜形成，參與血管內皮損傷的修復過程。而在多種血管疾病危險因素存在和動脈粥樣硬化血管疾病發(fā)生時，循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量和功能下降，并且與內皮依賴舒張功能的減退密切相關。所以，內皮祖細胞是修復動脈粥樣硬化血管內皮損傷的理想種子細胞。 研究表明，在血管內皮損傷發(fā)生后，內皮祖細胞能歸巢至損傷血管部位，在局部發(fā)揮抗血栓特性、遷移增殖功能和抗氧化活性，參與血管內皮損傷的修復過程。

3、組織纖溶酶原激活物(Tissue-type plasminogen activator，t-PA)、纖溶酶原激活物抑制劑(Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)和前列環(huán)素(ProstaglandinI<,2>，PGI<,2>)是調節(jié)內皮祖細胞抗血栓活性的重要物質。t-PA是內皮祖細胞合成的主要抗血栓物質之一，對于內皮祖細胞維持抗血栓功能，防止局部血栓形成以及繼發(fā)的缺血性血管疾病具有重要的意義。P

4、AI-1是內皮祖細胞合成的對抗t-PA抗血栓作用的物質，PGI<,2>是前列腺素代謝途徑中的重要產物，具有抑制血小板聚集的作用。PGI<,2>很不穩(wěn)定，常轉化為無活性的代謝產物6-keto-PGF1 α。由于切應力調控內皮祖細胞功能的基礎和臨床應用研究6-keto-PGF1 α性質較為穩(wěn)定，常作為檢測PGI<,2>的替代指標。內皮祖細胞分泌t-PA和PGI<,2>增多，PAI-1水平減少有利于防止損傷血管內皮局部的血栓形成。內皮型一氧化

5、氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是調節(jié)內皮祖細胞功能的重要功能蛋白，能催化L-精氨酸產生一氧化氮(Nitric oxide，NO)，調節(jié)內皮祖細胞的遷移和增殖等功能，在其修復血管內皮損傷的過程中起著重要的作用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)主要調節(jié)內皮祖細胞的抗氧化及抗細胞凋亡能力，可以清除氧自由基和其他氧化物質，并減少NO的滅活。其中，Cu/Zn

6、-SOD是機體內SOD的主要類型，通過檢測Cu/Zn-SOD可大致反映總的SOD活性。因此，t-PA、eNOS和SOD是介導內皮祖細胞抗血栓特性、遷移增殖功能和抗氧化活性的重要物質。通過尋找理想的理化及分子生物學方法，上調內皮祖細胞t-PA、eNOS和SOD的基因表達，是以細胞療法為基礎防治動脈粥樣硬化血管疾病內皮損傷的重要手段。 血管生物學研究表明，切應力可作用于血管內皮細胞，引起內皮細胞結構和功能的適應性改變，是一種非常重要

7、的內皮功能調節(jié)因素。目前，研究發(fā)現(xiàn)提高切應力能增加成熟內皮細胞t-PA、eNOS和SOD的表達，但有關切應力對內皮祖細胞t-PA、eNOS和SOD的調節(jié)作用尚不清楚。因此，本研究構建內皮祖細胞體外培養(yǎng)模型，觀察體外切應力對內皮祖細胞t-PA、eNOS和Cu/Zn-SOD基因表達的影響，分析不同體外切應力下內皮祖細胞分泌t-PA、PAI-1和PGI<,2>等抗血栓物質、產生NO以及Cu/Zn-SOD活性的變化，進一步探討流體切應力對內皮祖

8、細胞功能活性的調節(jié)作用；構建小徑人工血管在體移植動物模型，觀察體外切應力處理內皮祖細胞對小徑人工血管在體移植模型內皮化和通暢率的影響。 運動鍛煉通過提高在體血流切應力，可以保護血管內皮功能，促進心血管健康和預防心血管疾病。近來研究發(fā)現(xiàn)運動可以增加冠心病和和外周缺血性血管疾病患者內皮祖細胞數(shù)量和功能，提示運動對內皮祖細胞的調節(jié)可能是其改善內皮功能的作用機制之一。然而，有關運動對健康成人循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量和功能的影響及其機制尚不完全

9、清楚。由于NO、血管內皮生長因子fVascular endothelialgrowth factor，VEGF)和粒一巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony stimulating factor，GM-CSF)是調節(jié)內皮祖細胞數(shù)量和功能的重要物質，我們假設運動能上調健康成人循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量和功能，并且其作用可能與NO、切應力調控內皮祖細胞功能的基礎和臨床應用研究VEGF和GM-CSF有關。因此，

10、本文采用急性運動研究模型，以流式細胞法和細胞培養(yǎng)熒光標記法等方法觀察健康人循環(huán)內皮祖細胞的數(shù)量，檢測內皮祖細胞的黏附、遷移和增殖能力，測定血漿和內皮祖細胞分泌NO、VEGF和GM-CSF水平，并分析運動調節(jié)健康成人循環(huán)內皮祖細胞NO、VEGF和GM-CSF之間的可能聯(lián)系，以探討運動對健康成人循環(huán)內皮祖細胞的調節(jié)機制。本研究包括四個部分： 第一部分 內皮祖細胞體外培養(yǎng)模型的構建 目的：體外誘導外周血單個核細胞分化為內皮祖細

11、胞，探討內皮祖細胞的適宜生長條件，構建外周血內皮祖細胞的體外培養(yǎng)模型。 結論：體外誘導外周血單個核細胞分化為內皮祖細胞取材方便，簡便易行，可作為構建內皮祖細胞體外培養(yǎng)模型的理想途徑。其中，VEGF和Fn對內皮祖細胞的體外誘導分化生長起著重要的作用。 第二部分體 外切應力處理對內皮祖細胞功能的調節(jié) 目的：觀察體外切應力對內皮祖細胞t-PA、eNOS和Cu/Zn-SOD基因表達的影響，分析不同體外切應力下內皮祖細胞分

12、泌t-PA、PAI-1和PGI<,2>等抗血栓物質、產生NO以及Cu/Zn-SOD活性的變化，探討流體切應力對內皮祖細胞功能活性的調節(jié)作用。 結論：體外切應力能上調內皮祖細胞t-PA的基因表達，促進內皮祖細胞t-PA分泌，抑制PAI-1分泌，促進內皮祖細胞分泌PGI<,2>，改善內皮祖細胞抗血栓能力；上調內皮祖細胞eNOS基因表達，促進內皮祖細胞NO分泌，有助于改善其遷移增殖功能；上調內皮祖細胞Cu/Zn-SOD基因表達，增強內

13、皮祖細胞Cu/Zn-SOD活性，提高內皮祖細胞的抗氧化活性。因此，在生理范圍內增加體外切應力，能上調內皮祖細胞的功能活性，是提高內皮祖細胞修復血管內皮損傷能力的重要策略。 第三部分 體外切應力處理內皮祖細胞對小徑人工血管在體移植模型的影響 目的：研究體外切應力處理內皮祖細胞對小徑人工血管在體移植模型內皮化和通暢率的影響，通過在體模型進一步探討體外切應力對內皮祖細胞功能的調節(jié)作用。 結論：切應力處理內皮祖細胞能加

14、速小徑人工血管在體移植模型的內皮化，改善人工血管移植通暢率，這種作用可能與切應力處理促進內皮祖細胞NO分泌，增強其遷移和增殖功能，并增加內皮祖細胞分泌t-PA、PAI-1和：PGI<,2>等抗血栓物質，增強其抗血栓能力有關。 第四部分 運動對健康成人循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量和功能的調節(jié)及其機制 目的：采用急性運動研究模型，觀察運動對健康成人循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量和功能的影響，探討運動對循環(huán)內皮祖細胞可能的調節(jié)機制。 結論：

15、急性運動不僅能迅速增加健康成人循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量，還能上調循環(huán)內皮祖細胞的遷移和增殖功能，這種作用與其誘導NO釋放增多有關。但是，急性運動上調健康成人循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量和功能的維持時間較為短暫，其機制可能與急性運動后血漿NO水平的下降有關，提示可能需要長期運動鍛煉以維持對健康成人循環(huán)內皮祖細胞數(shù)量和功能的上調作用。因此，運動能上調健康成人循環(huán)內皮祖細胞的數(shù)量和功能，表明提高在體血流切應力是增加內源性血管內皮損傷修復能力的重要手段。