干擾素誘導(dǎo)蛋白Ifi204對(duì)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞功能調(diào)控的研究.pdf

1、目的：通過抑制及過表達(dá)干擾素誘導(dǎo)蛋白Ifi204（Interferon Inducible Protein204，Ifi204），觀察其調(diào)控血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）增殖、分化和血管形成的能力。
　　方法：提取C57BL/6小鼠骨髓全部細(xì)胞，采用密度梯度離心法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，EBM-2培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)獲得EPCs。使用DAPI染色和DiI-Ac-LDL內(nèi)吞、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行

2、EPCs鑒定。通過提取第3天到第14天EPCs的全部RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR），結(jié)果顯示第7天EPCs表達(dá)基因Ifi204最高，確定轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間。于第7天進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染及慢病毒（Lenti-Virus，LV）轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別獲得低表達(dá)Ifi204及過表達(dá)Ifi204的EPCs，并通過RT-qPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)導(dǎo)效果驗(yàn)證。將正常組EPCs、過表達(dá)Ifi204組EPCs及低表達(dá)Ifi204組EPCs等三組細(xì)胞分別

3、抽提全部RNA，進(jìn)行RT-qPCR、流式細(xì)胞檢測(cè)以及免疫熒光染色，驗(yàn)證EPCs特異性分子標(biāo)記物（包括CD31、VE-Cadherin、vWF等）表達(dá)水平。將三組細(xì)胞進(jìn)行管樣形成實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證EPCs的血管形成能力及克隆增殖活力。最后進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，建立C57BL/6小鼠下肢缺血模型，分別于缺血部位局部注射三組EPCs，其中正常組及siRNA組細(xì)胞使用TPE-11標(biāo)記（TPE-11是新近合成了一種納米材料，由一個(gè)含有四苯乙烷的雙頭

4、基親分子和兩個(gè)含有吡啶鹽末端的烷基組成，簡(jiǎn)稱TPE-11）、慢病毒組自帶GFP熒光，激光多普勒檢測(cè)手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后14天小鼠缺血下肢血流恢復(fù)情況，組織切片免疫熒光染色觀察缺血部位血管新生以及移植細(xì)胞存活量。
　　結(jié)果：DAPI染色和DiI-Ac-LDL內(nèi)吞、qPCR及流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證結(jié)果顯示EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞符合血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的特性。熒光顯微鏡提示 siRNA轉(zhuǎn)染效率及Lenti-Virus轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均在90％以上，RT-q

5、PCR提示siRNA抑制基因Ifi204表達(dá)量大于50%、Lenti-Virus使Ifi204表達(dá)量升高超過100%；流式細(xì)胞術(shù)以及免疫熒光染色提示siRNA組EPCs特異性分子標(biāo)志物（包括CD31、VE-Cadherin、vWF等）表達(dá)明顯下降，Lenti-Virus組升高。功能實(shí)驗(yàn)中，siRNA組血管形成能力較正常組明顯降低，Lenti-virus組較正常組升高；siRNA組增殖能力較正常組明顯降低，Lenti-Virus組較正常組

6、升高。成功建立C57BL/6小鼠下肢缺血模型，激光多普勒檢測(cè)驗(yàn)證手術(shù)當(dāng)天手術(shù)側(cè)下肢缺血明顯，術(shù)后14天激光多普勒顯示過表達(dá)Ifi204的EPCs治療的小鼠下肢血流較對(duì)側(cè)恢復(fù)情況較正常EPCs組為高，低表達(dá)Ifi204的EPCs治療的小鼠下肢血流較對(duì)側(cè)恢復(fù)明顯較正常EPC組為低。冰凍切片免疫熒光染色顯示過表達(dá)Ifi204 EPCs治療的小鼠移植細(xì)胞存活量較正常EPCs組為高，低表達(dá)Ifi204的EPCs治療的小鼠移植細(xì)胞存活量較正常EPC