HGF基因?qū)ρ軆?nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的： 離體條件下從大鼠骨髓中分離出單個(gè)核細(xì)胞，使用特殊的培養(yǎng)基使其向內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）分化生長，并將HGF基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中HGF的表達(dá)及HGF基因?qū)υ囵B(yǎng)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響。 方法： 1.取4-6周齡Wistar大鼠（120-150g）雙下肢股骨及脛骨骨髓，利用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，并使用內(nèi)

2、皮系專用培養(yǎng)液EGM-2MV誘導(dǎo)培養(yǎng)，使其分化為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長情況，通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞攝取DiL-acLDL、結(jié)合FITC-UEA-1，從功能角度鑒定細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)測定細(xì)胞表面抗原CD133、flk-1、VE-cadherin（CD144）及CD31進(jìn)一步鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。 2.提取和擴(kuò)增pIRES2-EGFP-HGF質(zhì)粒，以陽離子脂質(zhì)體（Lipofectami

3、neTM2000）介導(dǎo)pIRES2-EGFF-HGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮祖細(xì)胞并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；采用ELISA法檢測轉(zhuǎn)染后HGF蛋白的表達(dá)情況；用MTT法檢測HGF基因?qū)PCs增殖的促進(jìn)作用。 結(jié)果： 1.成功分離和培養(yǎng)出大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，并通過細(xì)胞功能檢測和流式細(xì)胞術(shù)檢測表面抗原來鑒定。 2.成功將HGF基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白的表達(dá)；在HGF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到HG

4、F的表達(dá)，1天、2天、3天、5天、7天濃度分別為638.48±66.91、1230.33±96.35、2097.88±138.32、4017.20±169.92、1869.87±101.22（pg/ml），而空載質(zhì)粒組和陰性對(duì)照組沒有檢測出HGF的表達(dá)；轉(zhuǎn)染后HGF基因?qū)υ囵B(yǎng)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞生長有顯著的促增殖作用，轉(zhuǎn)染5天和7天，轉(zhuǎn)染組血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖明顯加快，與空載質(zhì)粒組及陰性對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。