飛蝗2個(gè)CYP450轉(zhuǎn)基因果蠅品系對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性及原核表達(dá).pdf

1、細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，P450）是龐大的家族酶系，在昆蟲(chóng)內(nèi)源及外源化合物代謝中發(fā)揮著重要作用。飛蝗（Locusta migratoria）是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，揭示其體內(nèi)P450代謝解毒功能對(duì)飛蝗有效治理尤為必要。本文以飛蝗2個(gè)P450基因CYP408B1和CYP409A1為靶標(biāo)，將其分別轉(zhuǎn)入果蠅（Drosophila melanogaster）體內(nèi)，成功建立了轉(zhuǎn)基因果蠅品系，測(cè)定了果蠅對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性以及P45

2、0總酶活性；針對(duì)CYP408B1和CYP409A1構(gòu)建了重組質(zhì)粒，利用大腸桿菌（Escherichia coli）原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行體外異源共表達(dá)，為探索飛蝗 CYP408B1和 CYP409A1基因?qū)⑾x(chóng)劑的代謝解毒功能提供依據(jù)。本文主要研究?jī)?nèi)容有：
　　一、飛蝗2個(gè)P450轉(zhuǎn)基因果蠅品系對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性研究
　　采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)飛蝗P450基因CYP408B1和CYP409A1的純合果蠅品系，分別選擇雄性轉(zhuǎn)基因果

3、蠅 UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和親本果蠅attp40與 tub-gal4的處女果蠅雜交，提取子一代啟動(dòng)目的基因 CYP408B1和CYP409A1表達(dá)的轉(zhuǎn)基因果蠅品系tub>CYP408B1和tub>CYP409A1以及對(duì)照組果蠅品系tub>attp40的DNA和總RNA，將RNA體外反轉(zhuǎn)錄為cDNA。分別以DNA和cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而驗(yàn)證構(gòu)建好的轉(zhuǎn)基因果蠅品系UAS-CYP408B1和UAS-C

4、YP409A1。以DNA為模板的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組tub>CYP408B1和tub>CYP409A1中均可檢測(cè)到目的條帶，大小分別為1555 bp和1585 bp，表明已成功的將飛蝗CYP408B1和CYP409A1插入果蠅體內(nèi)；以cDNA為模板的 RT-PCR和 RT-qPCR，實(shí)驗(yàn)組中均有目的條帶且表達(dá)量較高，表明轉(zhuǎn)基因果蠅品系tub>CYP408B1和tub>CYP409A1中目的基因均可大量表達(dá)。
　　通過(guò)殺蟲(chóng)劑生

5、物學(xué)測(cè)定，進(jìn)一步分析了轉(zhuǎn)基因果蠅品系 tub>CYP408B1、tub>CYP409A1以及對(duì)照組tub>attp40、UAS-CYP408B1、UAS-CYP409A1和attp40對(duì)溴氰菊酯、馬拉硫磷和毒死蜱3種殺蟲(chóng)劑的敏感性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組tub>CYP408B1和 tub>CYP409A1對(duì)溴氰菊酯的抗藥性均較對(duì)照組為高，且與tub>attp40相比，抗性比分別為1.59和1.83，而對(duì)馬拉硫磷和毒死蜱的抗性比并未提高。<

6、br>　　采用熒光法定量測(cè)定轉(zhuǎn)基因果蠅品系tub>CYP408B1、tub>CYP409A1以及對(duì)照組tub>attp40中細(xì)胞色素P450的總酶活性，測(cè)定結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組tub>CYP408B1和tub>CYP409A1的總酶活性與對(duì)照組tub>attp40相比，均無(wú)顯著性差異。
　　二、飛蝗2個(gè)P450基因的原核表達(dá)
　　采用ompA+2策略對(duì)飛蝗CYP408B1和CYP409A1的氮端進(jìn)行修飾，依次插入表達(dá)載體pCWo

7、ri的NdeI處；采用pelB策略修飾飛蝗CPR（NADPH細(xì)胞色素P450還原酶）的氮端，首先同上插入 pCWori，隨后再轉(zhuǎn)入帶有 p15A的表達(dá)載體pAC-Kan-alphaGal4中，從而完成重組質(zhì)粒（pCW/CYP408B1、pCW/CYP409A1和pAC/CPR）的構(gòu)建。通過(guò)PCR和測(cè)序鑒定構(gòu)建的重組質(zhì)粒，PCR鑒定結(jié)果顯示：片段大小分別為1642 bp、1654 bp和2143 bp，大小與預(yù)期相近，且測(cè)序結(jié)果表明插入的

8、基因序列正確無(wú)誤。
　　將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCW/CYP408B1和pCW/CYP409A1分別與pAC/CPR在大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá)或單獨(dú)表達(dá)。不同條件誘導(dǎo)的原核表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示：CYP409A1和CPR均可表達(dá)，蛋白分子量分別約為58 ku和77 ku，但均為包涵體，而CYP408B1未能成功表達(dá)。
　　綜上所述，本文利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功構(gòu)建了轉(zhuǎn)飛蝗 P450基因 CYP408B1和CYP409A1的