轉棉蚜羧酸酯酶基因果蠅品系的構建與抗性研究.pdf

1、殺蟲劑的廣泛使用，迫使昆蟲產生抗藥性以適應環(huán)境的變化和各種選擇壓。有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類和擬除蟲菊酯類等化學殺蟲劑是人們最常使用的。抗藥性產生的分子機制主要包括代謝抗藥性和靶標抗藥性，代謝抗藥性主要是指抗藥性蛋白的表達水平或活性的變化，如非特異性羧酸酯酶的過量表達和活性增強，及P450單加氧酶、谷胱甘肽S轉移酶的擴增等。靶標抗藥性主要是指殺蟲劑的靶標蛋白敏感性的變化，如鈉離子通道、乙酰膽堿酯酶及γ-氨基丁酸受體的突變等。昆蟲羧

2、酸酯酶通過降解有機磷類殺蟲劑而產生的抗藥性機制有兩種，一種是通過基因擴增或轉錄調控導致蛋白的過量表達，另一種是編碼酯酶的基因序列發(fā)生突變，使酶的性質改變而獲得有機磷水解酶活性。
　　本論文應用轉基因果蠅技術，采用經典的Ga14/UAS系統(tǒng)，成功構建了3種轉棉蚜羧酸酯酶基因果蠅品系：轉野生型基因(Est-wild)純合果蠅品系、轉A151D位點突變型基因(Est-A151D)純合果蠅品系、轉W271L位點突變型基因(Est-W271

3、L)純合果蠅品系。轉基因果蠅品系與Ga14果蠅品系雜交，啟動了棉蚜羧酸酯酶基因在果蠅體內的表達。對轉基因果蠅進行分子生物學驗證，熒光定量PCR結果顯示，3種外源的羧酸酯酶基因轉入果蠅基因組的拷貝數都是單拷貝，在轉錄組水平上，3種羧酸酯酶基因在果蠅體內也沒有顯著性差異。對轉基因果蠅進行羧酸酯酶活性的檢測，淀粉凝膠電泳圖定性的顯示出野生型羧酸酯酶活性明顯高于兩突變型，酶活性定量測定結果顯示野生型羧酸酯酶活性為突變型的2-3倍。分子生物學和酶

4、活測定結果說明在果蠅體內棉蚜羧酸酯酶發(fā)生突變后會失去原有的酯酶活性。通過對轉基因果蠅進行生物學測定發(fā)現(xiàn)，轉A151D和W271L突變型棉蚜羧酸酯酶基因果蠅對毒蟲畏的抗藥性明顯高于轉野生型基因果蠅，而對馬拉硫磷、對硫磷、久效磷和溴氰菊酯都沒有提高抗藥性，說明羧酸酯酶基因突變可以使其獲得更高的對毒蟲畏的有機磷水解酶活性，而其原有的酯酶活性喪失。相對W1118×Ga14對照組果蠅，3種轉棉蚜羧酸酯酶基因果蠅對馬拉硫磷、對硫磷、溴氰菊酯抗藥性均