飛蝗羧酸酯酶基因的分子特性及組織定位.pdf

1、飛蝗是我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要害蟲，長(zhǎng)期的化學(xué)農(nóng)藥防治使得飛蝗對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，這種現(xiàn)象不僅使得飛蝗的治理難度加大，而且產(chǎn)生農(nóng)藥殘留問題，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的污染。羧酸酯酶家族屬于昆蟲三大代謝酶系之一，在飛蝗抗藥性產(chǎn)生中起著重要的作用。為進(jìn)一步闡明羧酸酯酶殺蟲劑代謝解毒的分子機(jī)制，本文在前人研究基礎(chǔ)上，基于飛蝗EST及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到羧酸酯酶基因序列，對(duì)其進(jìn)行分析，從中篩選出兩個(gè)基因全長(zhǎng)序列，開展了基因表達(dá)、功能分析和組織定位等系

2、統(tǒng)性研究。
　　一、飛蝗羧酸酯酶基因cDNA序列的驗(yàn)證及分析
　　采用PCR技術(shù)克隆驗(yàn)證羧酸酯酶基因LmCarE26和LmCarE27的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果表明:LmCarE26全長(zhǎng)2176 bp，開放閱讀框（ORF）1614bp，編碼538個(gè)氨基酸;LmCarE27全長(zhǎng)1520 bp，ORF1410 bp，編碼470個(gè)氨基酸。兩個(gè)基因的氨基酸序列均具有羧酸酯酶保守的催化位點(diǎn)，證明其確實(shí)為羧酸酯酶基因。兩個(gè)

3、羧酸酯酶預(yù)測(cè)分子量分別為59.8和52.2 kD，等電點(diǎn)分別為6.22和5.98。兩個(gè)羧酸酯酶均未預(yù)測(cè)到信號(hào)肽序列。
　　二、飛蝗羧酸酯酶基因不同組織部位和不同發(fā)育階段的表達(dá)
　　采用Rael-time PCR法，檢測(cè)羧酸酯酶基因LmCarE26和LmCarE27在飛蝗不同組織部位和不同發(fā)育階段的表達(dá)。結(jié)果表明:兩個(gè)羧酸酯酶基因在飛蝗九個(gè)組織部位都有表達(dá)，其中血液、腦、前腸、后腸和肌肉表達(dá)較低，中腸、胃盲囊、馬氏管和脂肪體表

4、達(dá)較高，LmCarE26和LmCarE27在中腸與胃盲囊兩個(gè)組織部位均有較高的表達(dá)，LmCarE27在胃盲囊表達(dá)最高，而LmCarE26在脂肪體表達(dá)最高。兩個(gè)羧酸酯酶基因在整個(gè)飛蝗發(fā)育過程中均有較高水平表達(dá)。LmCarE26在飛蝗不同發(fā)育階段的表達(dá)模式類似于保幼激素酯酶(JHE)。
　　三、飛蝗羧酸酯酶基因?qū)r(nóng)藥的代謝解毒功能
　　采用RNAi技術(shù)，結(jié)合農(nóng)藥點(diǎn)滴，研究了兩個(gè)羧酸酯酶基因分別沉默后對(duì)馬拉硫磷(Malathion

5、)、溴氰菊酯（Deltamethrin）、毒死蜱（Chlorpyrfos）和西維因(Carbaryl)4種農(nóng)藥的敏感性。結(jié)果顯示:沉默羧酸酯酶基因LmCarE26后，點(diǎn)滴馬拉硫磷、西維因和溴氰菊酯三種農(nóng)藥，處理組的死亡率比對(duì)照組分別增加了31％、15％和29.5％，點(diǎn)滴毒死蜱后死亡率無明顯變化;沉默羧酸酯酶基因LmCarE27后，點(diǎn)滴4種農(nóng)藥，處理組與對(duì)照組死亡率均沒有明顯的變化，表明LmCarE26可能對(duì)馬拉硫磷、西維因和溴氰菊酯三種

6、農(nóng)藥的代謝解毒起重要作用。
　　四、飛蝗羧酸酯酶基因的組織定位
　　采用原位雜交技術(shù)對(duì)羧酸酯酶基因LmCarE26和LmCarE27進(jìn)行組織定位，結(jié)果表明LmCarE26和LmCarE27在胃盲囊柱狀細(xì)胞的頂端和基部處有較高表達(dá)，這兩個(gè)部位代謝酶類的合成較為旺盛。此結(jié)果從組織細(xì)胞水平進(jìn)一步印證了第三章LmCarE26和LmCarE27在胃盲囊高表達(dá)現(xiàn)象。
　　綜上所述，本文研究了飛蝗兩個(gè)羧酸酯酶基因的表達(dá)模式、采用RN