基于單細(xì)胞檢測技術(shù)的exosome與細(xì)胞作用研究.pdf

1、Exosome是由多種細(xì)胞分泌的一種納米級(jí)囊泡,通過結(jié)合在受體細(xì)胞表面或進(jìn)入受體細(xì)胞,參與許多重要的生理、病理過程。近年來,由于發(fā)現(xiàn)其在腫瘤免疫治療中的重大價(jià)值,以及能在細(xì)胞間傳遞蛋白、mRNA、microRNA(miRNA)等活性物質(zhì),exosome正受到越來越多的關(guān)注。但是由于exosome的尺寸太小,用常規(guī)的方法很難直接觀測,目前exosome與細(xì)胞相互作用的過程還不清楚,機(jī)理也不明確。相關(guān)的研究大多集中于exosome與細(xì)胞作用

2、之后的分子鑒定,而對(duì)作用過程本身缺乏深入研究。例如,exosome進(jìn)入受體細(xì)胞的方式存在很多爭議。Exosome進(jìn)入細(xì)胞后的運(yùn)輸,以及活性物質(zhì)釋放過程還很不清楚。關(guān)于exosome中含有的惡性miRNA等物質(zhì)能否危害到受體細(xì)胞的問題,報(bào)道還很少。這些問題制約了exosome功能的研究,影響到在疾病預(yù)防、檢測和治療中的應(yīng)用。本文的研究目標(biāo)是發(fā)展各種高時(shí)、空分辨,高靈敏的檢測技術(shù),探討exosome的提取、表征與標(biāo)記等方法,研究細(xì)胞攝入ex

3、osome的過程與機(jī)理,以及exosome進(jìn)入胞內(nèi)的運(yùn)輸與命運(yùn),研究exosome對(duì)受體細(xì)胞的功能作用等,取得如下新性成果:
　　 1、應(yīng)用先進(jìn)的光子學(xué)技術(shù),建立了高靈敏和高分辨的單細(xì)胞檢測平臺(tái),并用于直接觀察exosome與細(xì)胞的相互作用。在高質(zhì)量顯微成像的基礎(chǔ)上,發(fā)展了單粒子追蹤技術(shù)和高通量顯微術(shù)兩種定量分析exosome與細(xì)胞作用的方法。該方法不僅能追蹤exosome與單個(gè)細(xì)胞作用時(shí)的運(yùn)動(dòng)軌跡,獲得exosome的動(dòng)態(tài)參數(shù)

4、和運(yùn)動(dòng)模式,還能一次獲得大量細(xì)胞的高分辨圖像,進(jìn)而統(tǒng)計(jì)exosome與細(xì)胞相互作用的規(guī)律。
　　 2、應(yīng)用活細(xì)胞顯微術(shù)和單粒子追蹤技術(shù)對(duì)exosome與細(xì)胞作用過程進(jìn)行了系統(tǒng)研究,結(jié)果表明:exosome在溶液中,細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)模式有很大不同,分別是自由擴(kuò)散,慢速漂移,以及限制性非常規(guī)運(yùn)動(dòng)和快速徑直運(yùn)動(dòng)相交替的模式。發(fā)現(xiàn)exosome的蛋白成分在胞內(nèi)從exosome的囊泡結(jié)構(gòu)中釋放出來,進(jìn)入溶酶體,而脂質(zhì)成分被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞

5、膜上。
　　 3、應(yīng)用高通量顯微術(shù),系統(tǒng)地研究了exosome進(jìn)入細(xì)胞的途徑,結(jié)果表明:低溫環(huán)境和細(xì)胞骨架的擾亂都會(huì)抑制exosome進(jìn)入細(xì)胞。根據(jù)十八烷基羅丹明B標(biāo)記exosome的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得出exosome是通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。通過氯丙嗪、染料木黃酮、阿米洛利等藥物抑制劑,以及使用siRNA干擾網(wǎng)格蛋白或凹陷蛋白,分別阻斷細(xì)胞的網(wǎng)格蛋白依賴胞吞、凹陷蛋白依賴胞吞、以及大胞飲等途徑,得出exosome經(jīng)由網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞

6、和大胞飲兩種途徑進(jìn)入細(xì)胞。
　　 4、通過PC12細(xì)胞的exosome對(duì)HeLa細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的影響,深入研究了exosome介導(dǎo)miR-21所起的功能作用。結(jié)果表明:HeLa細(xì)胞在攝入PC12細(xì)胞來源的exosome之后,其細(xì)胞內(nèi)PTEN的表達(dá)水平下降,而BMSC中的TGFβ RⅡ和STAT3的表達(dá)下降。通過miRNA抑制劑實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些基因表達(dá)的下降與miR-21的傳遞有很大關(guān)聯(lián)。結(jié)合定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表

7、明PC12細(xì)胞來源的exosome能傳遞miR-21及其前體到HeLa細(xì)胞和BMSC。
　　 綜上所述,本論文系統(tǒng)研究了exosome與細(xì)胞作用過程的行為規(guī)律、攝入途徑和功能作用,得到了有意義的結(jié)果,對(duì)exosome的細(xì)胞攝入,胞內(nèi)運(yùn)輸以及最終命運(yùn)提出了新的認(rèn)識(shí),初步證實(shí)了癌細(xì)胞來源的exosome能將惡性miRNA導(dǎo)入正常細(xì)胞或不同物種的細(xì)胞,分別影響不同靶基因的表達(dá)。文本的研究結(jié)果有助于深入理解exosome與細(xì)胞的相互作用