間質干細胞成脂分化熒光報告基因體系的建立及其應用.pdf

1、人體內的脂肪細胞在維持機體能量代謝平衡和體內穩(wěn)態(tài)過程中具有相當重要的作用。脂肪細胞通過分泌各種各樣的細胞因子，來調節(jié)機體內包括糖、脂代謝，炎癥反應，血管生成等多種生命活動。脂肪細胞的功能失調將導致各種代謝性疾病的發(fā)生，例如Ⅱ型糖尿病和心血管疾病等。通過篩選作用于脂肪形成過程中的特異性物質，如小分子化合物、microRNA或細胞因子等，我們不僅可以了解脂肪組織的發(fā)育過程，而且能夠從中尋找到治療代謝性疾病的新方法。
　　 目前，絕大

2、多數的篩選實驗都以小鼠細胞系作為細胞模型進行檢測，如3T3-F442A等。由于小鼠細胞與人類細胞間存在基因序列的差異，小鼠細胞系并不能作為理想細胞模型進行人體組織細胞的分化研究。人骨髓間質干細胞(Human mesenchymal stem cell，hMSCs)是一群來源于人體骨髓的成體干細胞。這群細胞不僅具有自我更新和多向分化潛能，并且能夠很好的模擬人體內脂肪細胞的形成過程。因此，hMSCs作為人體內脂肪形成的天然模擬細胞，被認為是

3、體外研究脂肪形成的理想細胞模型。
　　 另外，用于高通量篩選的方法主要有三種，即熒光素酶檢測法、抗體標記檢測法和熒光報告基因檢測法。相對而言，熒光素酶檢測法和抗體標記檢測法不僅耗時耗力，而且需要固定或者裂解細胞，不能夠實現“活”細胞狀態(tài)下的檢測。熒光報告基因檢測法不單檢測過程簡單易行，其“活”細胞檢測的優(yōu)點更方便于研究人員進行實驗觀察及評價。而在熒光報告基因檢測方法的基礎上，引入組織特異性啟動子，就能夠特異的指示細胞的分化狀態(tài)。

4、aP2基因(adipocyte Protein 2)是成熟脂肪細胞的一個特異性的標志物，同時也是脂肪形成的一個關鍵性調節(jié)因子-PPARgamma(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)的靶基因之一。aP2啟動子攜帶熒光報告基因的方法能夠特異的指示脂肪細胞的分化過程?；诖?，本課題建立了基于脂肪細胞特異性啟動子aP2的熒光報告基因檢測系統(tǒng)(aP2hrGFP-hMSCs)。通過一系

5、列的鑒定實驗，證明了該系統(tǒng)中熒光報告基因的表達與脂肪細胞的分化情況密切相關，并且能夠簡易的通過熒光酶標儀來檢測熒光報告基因的表達情況。最后，利用該系統(tǒng)對已知的成脂相關小分子化合物進行檢測，證明其能夠應用于多種物質的篩選。
　　 aP2hrGFP-hMSCs作為一種實時、靈敏、高效的“活”細胞檢測系統(tǒng)，具有相當廣泛的應用前景。首先，作為模擬人體脂肪形成過程的天然細胞模型，它可以應用于體內脂肪形成的機理研究，揭示脂肪組織的發(fā)育過程。

6、其次，它能夠實現人體脂肪形成相關物質的高通量篩選，有利于代謝性疾病的新藥研究。最后，該模型高效而特異性的檢測優(yōu)勢，還可以服務于脂肪細胞相關的毒理學研究。
　　 本研究旨在建立aP2hrGFP-hMSCs檢測系統(tǒng)，并且探討其作為脂肪形成研究模型的可行性。本實驗包括以下三個部分：
　　 第一部分：利用多位點Gateway技術構建慢病毒載體。獲得pLV/Final-puro-aP2-hrGFP表達載體，并得到高滴度的病毒原液。

7、
　　 第二部分：hMSCs的轉染以及aP2hrGFP-hMSCs的鑒定。證明aP2hrGFP-hMSCs具有與hMSCs一樣的細胞表型并保持多向分化潛能。通過正常成脂誘導以及成脂抑制劑-Ly294002實驗，證實熒光報告基因的表達能夠準確的反映aP2基因的變化情況，以及熒光強度能夠通過熒光酶標儀進行準確而快速的檢測。
　　 第三部分：aP2hrGFP-hMSCs檢測系統(tǒng)的應用。利用aP2hrGFP-hMSCs檢測Tro