枯否細胞HO-1過表達阻斷肥大細胞脫顆粒抑制DC成熟和歸巢的機制研究.pdf

1、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase1，HO-1）是機體的一種自我保護性蛋白，在很多疾病模型中通過抗炎癥、抗細胞增殖和抗細胞凋亡來發(fā)揮保護作用。結合我們前期的研究，通過上調供肝的 HO-1一方面可以穩(wěn)定肥大細胞膜來減輕缺血再灌注造成的損傷；另一方面通過此機制可以抑制急性免疫排斥反應。對HO-1進行細胞定位的研究發(fā)現，上調的肝臟的HO-1主要定位于肝臟內的枯否細胞。同時提出了供肝前置狀態(tài)的概念。在上述的預實驗結果的基礎上，我們提

2、出了相關假設：通過上調枯否細胞的 HO-1可以穩(wěn)定肥大細胞的細胞膜，減少其脫顆粒，從而抑制樹突狀細胞的成熟降低其抗原提呈的能力，減少樹突狀細胞表面歸巢受體的表達阻斷其歸巢，從而發(fā)揮減輕免疫排斥的作用。
　　為了驗證上述的假說我們提出此實驗設計：門靜脈灌注酶消化，密度梯度離心法分離提取肝臟的枯否細胞，流式細胞術鑒定其表面標記，觀察其形態(tài)與功能。通過不同的處理因素（PBS、DMSO、 Hemin、Znpp）對枯否細胞進行預處理，運用實

3、時熒光定量PCR、western blot技術檢測枯否細胞的HO-1的核酸和蛋白的表達變化。經過預處理的枯否細胞通過與肥大細胞（mast cells MCs）接觸和隔離共培養(yǎng)檢測其脫顆粒程度來觀察肥大細胞的膜穩(wěn)定情況，進一步觀察與枯否細胞相互作用后的肥大細胞對抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APCs）即樹突狀細胞(dendritic cells DCs)表面歸巢受體CCR7表達的影響和其表面共刺激分子表達

4、的影響觀察其歸巢遷移能力和成熟度；同時在體外建立單向混合淋巴細胞反應模型(mixed lymphocyte reaction，MLR)，檢測樹突狀細胞對同種異體淋巴細胞增殖能力的影響,評價過表達枯否細胞的 HO-1后對肥大細胞膜穩(wěn)定的影響，從而對樹突狀細胞的生物學功能影響。在體外闡明供肝前置狀態(tài)中枯否細胞、肥大細胞、樹突狀細胞這些免疫學細胞的相互作用機制。
　　第1部體外肝源性枯否細胞的分離、鑒定及HO-1表達
　　目的：<

5、br>　　為研究枯否細胞過表達HO-1對肥大細胞脫顆粒的影響并進一步對樹突狀細胞生物學功能的影響提供細胞基礎，并在體外觀察枯否細胞HO-1的表達變化。
　　方法：
　　門靜脈灌注酶消化，密度梯度離心法分離提取枯否細胞，流式細胞術檢測其特異性的表面分子，觀察其形態(tài)來鑒定所獲得枯否細胞的純度。將獲得的枯否細胞經過PBS、DMSO、Hemin、Znpp等因素進行預處理8h后，提取其總的核酸和總蛋白。實時熒光定量PCR觀察枯否細胞H

6、O-1的mRNA表達，采用Western blot法觀察枯否細胞HO-1蛋白的表達。
　　結果：
　　分離提取的枯否細胞在光鏡下觀察為圓形，處于懸浮和半貼壁狀態(tài)，符合文獻報道的枯否細胞特征。流式細胞術鑒定枯否細胞表面的特異性分子F4/80和CD11b雙陽性表達90％以上。分離提取的枯否細胞經Hemin處理8h后，其 HO-1在核酸和蛋白水平的表達明顯升高。而 Znpp組的 HO-1的核酸和蛋白與對照組相比差異變化較小。但與H

7、emin處理組相比有明顯變化。
　　結論：
　　通過門靜脈灌注酶消化，密度梯度離心法可以獲得足夠的枯否細胞為后續(xù)實驗作準備，體外經Hemin處理的枯否細胞可以高表達HO-1。
　　第2部枯否細胞HO-1的過表達對MC膜穩(wěn)定的影響
　　目的：
　　在前期中，我們驗證了上調肝臟的 HO-1可以穩(wěn)定肥大細胞膜從而減輕缺血再灌注損傷減輕急性排斥反應，并在體觀察氯化釓阻斷枯否細胞的功能后再上調其HO-1肝臟的缺血再灌

8、注損傷不能減輕，定位研究發(fā)現HO-1于枯否細胞內。為探討這一機制我們在體外實驗過表達枯否細胞的 HO-1，與肥大細胞相互作用后，刺激肥大細胞脫顆粒，觀察過表達HO-1的枯否細胞對肥大細胞膜穩(wěn)定的影響。
　　方法：
　　將分離提取的枯否細胞經PBS、DMSO、Hemin、Znpp各處理因素預處理8h后，收集預處理的細胞。將收集的細胞與肥大細胞接觸或者用transwell隔層共培養(yǎng)24h,用anti-DNP IgE mAb聯合D

9、NP-HAS來刺激肥大細胞使其脫顆粒，檢測β-內酰胺酶的活性來反應肥大細胞的脫顆粒情況的表達變化。流式細胞術鑒定肥大細胞表面的Fcε受體的表達。ELISA法檢測共培養(yǎng)細胞的細胞上清中的IL-9,IL-33，IFN-γ,IL-10,TGF-β等細胞因子來觀察枯否穩(wěn)定肥大細胞膜的可能機制。
　　結果：
　　過表達 HO-1的枯否細胞與肥大細胞無論是接觸共培養(yǎng)還是經過transwell隔層共培養(yǎng)，肥大細胞脫顆粒都明顯減少，肥大細胞

10、表面的 Fcε受體分子表達相對較低。過表達HO-1的枯否細胞與肥大細胞共培養(yǎng)體系中細胞上清細胞因子IL-9，IL-33，IL-10，TGF-β表達升高，IFN-γ表達下降。結論：
　　我們的實驗表明過表達 HO-1的枯否可以穩(wěn)定肥大細胞膜減少其脫顆粒，其可能的機制是上調枯否細胞的HO-1后分泌的細胞因子IL-9，IL-33，IL-10，TGF-β增加，這種細胞因子對穩(wěn)定肥大細胞膜有作用。
　　第3部枯否細胞過表達HO-1穩(wěn)定

11、MC膜后對DC生物學功能的影響
　　目的：
　　為了驗證我們提出的假說機制：過表達枯否細胞的HO-1穩(wěn)定肥大細胞膜后可以減少肥大細胞的脫顆粒，觀察膜穩(wěn)定的肥大細胞進一步對樹突狀細胞成熟度、歸巢能力和對同種異體淋巴細胞反應增殖能力等各生物學功能的影響。
　　方法：
　　將經過不同處理因素（PBS、DMSO、Hemin、Znpp）預處理的枯否細胞與肥大細胞相互作用并刺激肥大細胞脫顆粒后，在此培養(yǎng)體系中加入樹突狀細胞，

12、培養(yǎng)24小時。流式細胞術分析表面表達CD11c的細胞群中細胞表面的共刺激分子CD86、CD80和CD40的表達，并分析其表達CCR7歸巢受體的表達；Transwell觀察枯否細胞過表達HO-1穩(wěn)定肥大細胞膜后對樹突狀細胞的遷移能力的影響，ELISA檢測培養(yǎng)體系細胞上清中PGE2、 CCL21和CCL19的表達。CCK8檢測培養(yǎng)體系中的樹突狀細胞在單向混合淋巴細胞反應實驗中對同種異體淋巴細胞增殖反應能力的影響。
　　結果：
　

13、　過表達HO-1的枯否細胞穩(wěn)定肥大細胞膜刺激其脫顆粒后，與樹突狀細胞共培養(yǎng)，其表面的共刺激分子低表達，表面的歸巢受體CCR7相對于Znpp組表達下降，遷移能力下降。培養(yǎng)體系中細胞因子 PGE2、CCL21和 CCL19表述升高，刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力下降。
　　結論：
　　枯否細胞過表達HO-1穩(wěn)定肥大細胞膜減少其脫顆粒后可能是通過維持樹突狀細胞的非成熟狀態(tài)并阻斷其歸巢，降低其作為抗原提呈細胞刺激同種異體淋巴細胞的能