新型糖皮質(zhì)激素對肥大細(xì)胞脫顆粒的快速作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞分泌的一種類固醇(甾體)激素，是機(jī)體內(nèi)極為重要的一類調(diào)節(jié)分子，它對機(jī)體的發(fā)育、代謝等起著重要調(diào)節(jié)作用，也是臨床上使用廣泛的抗炎、抗過敏和免疫抑制劑。其生理功能包括對糖、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的調(diào)節(jié)、對循環(huán)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)、對免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)等。在機(jī)體遇到強(qiáng)烈應(yīng)激刺激時(shí)，糖皮質(zhì)激素分泌迅速增多，增強(qiáng)機(jī)體對有害刺激的抵抗力，維持器官、組織的正常功能活動(dòng)。因此，糖皮質(zhì)激素被

2、稱為應(yīng)激反應(yīng)的樞紐。除生理功能外，糖皮質(zhì)激素還在臨床上廣泛應(yīng)用，發(fā)揮抗炎、抗休克、抗過敏及免疫抑制等藥理作用。糖皮質(zhì)激素的藥用劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其生理劑量，二者產(chǎn)生的效應(yīng)也不完全一致，作用機(jī)制更是多種多樣，從而引起人們對糖皮質(zhì)激素作用機(jī)制的深入探索。糖皮質(zhì)激素作用機(jī)制的研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，并具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 既往普遍認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素是在與其胞內(nèi)(核)受體結(jié)合后，啟動(dòng)并調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的合

3、成，通過基因組機(jī)制實(shí)現(xiàn)其生理藥理功能，此即經(jīng)典的基因組機(jī)制。其特點(diǎn)是應(yīng)答時(shí)間較長，通常在三十分鐘以上，甚至長達(dá)數(shù)小時(shí)、數(shù)日。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素還存在不依賴基因組途徑的其它作用，稱之為非基因組作用，其特點(diǎn)為：作用快、恢復(fù)快；偶聯(lián)大分子的糖皮質(zhì)激素仍然發(fā)揮作用；不能被糖皮質(zhì)激素核受體拮抗劑、基因轉(zhuǎn)錄/蛋白合成抑制劑所阻斷。上述非基因組作用包括：特異性作用機(jī)制，即通過受體介導(dǎo)，非特異性作用機(jī)制，即通過與細(xì)胞膜蛋白或脂質(zhì)非特異性結(jié)合

4、，改變細(xì)胞膜的理化特性(如流動(dòng)性)或某些膜蛋白的微環(huán)境以發(fā)揮效應(yīng)。
　　 糖皮質(zhì)激素主要作為抗過敏、抗炎藥物和免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床，在對一些過敏性疾病和抑制炎癥的治療中，糖皮質(zhì)激素是目前最常用、最有效的藥物之一。在免疫細(xì)胞中，肥大細(xì)胞作為過敏反應(yīng)的原發(fā)效應(yīng)細(xì)胞之一，其在被抗原激活特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，不僅脫顆粒分泌炎性介質(zhì)，還分泌相當(dāng)數(shù)量的多種細(xì)胞因子，在過敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。前期研究已證實(shí)，糖皮質(zhì)激素及其

5、衍生物能夠快速抑制豚鼠過敏性哮喘反應(yīng)；糖皮質(zhì)激素能夠在短時(shí)間內(nèi)快速抑制肥大細(xì)胞脫顆粒且糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑及蛋白合成抑制劑不能阻斷其效應(yīng)。本課題合成了疏水性糖皮質(zhì)激素衍生物并與原合成的親水性糖皮質(zhì)激素衍生物作對照，以肥大細(xì)胞為研究對象，旨在進(jìn)一步探討糖皮質(zhì)激素快速抑制肥大細(xì)胞脫顆粒的分子機(jī)制。
　　 由此，本課題進(jìn)行了以下研究：
　　 1、糖皮質(zhì)激素衍生物的合成和鑒定：以氫化可的松為原料，苯丙氨酸為載體，與氫化可的松的2

6、1位羥基偶聯(lián)，合成氫化可的松-21-苯丙氨酸酯鹽酸鹽(HP)，并采用核磁共振氫譜和質(zhì)譜對糖皮質(zhì)激素衍生物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。以快速抑制中性粒細(xì)胞脫顆粒為指標(biāo)，對前期合成的系列糖皮質(zhì)激素衍生物進(jìn)行初篩，確定以氫化可的松-21-甘氨酸酯鹽酸鹽(HG)為樣本，研究糖皮質(zhì)激素衍生物對肥大細(xì)胞脫顆粒的影響及其機(jī)制。
　　 2、新型糖皮質(zhì)激素對肥大細(xì)胞脫顆粒的影響：建立體外抗原激發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒模型，以熒光法檢測組胺釋放，研究糖皮質(zhì)激素衍生物在不

7、同劑量、不同時(shí)間對肥大細(xì)胞脫顆粒的影響。
　　 3、糖皮質(zhì)激素及其衍生物對肥大細(xì)胞脫顆粒作用的分子機(jī)制：應(yīng)用熒光偏振法檢測肥大細(xì)胞胞膜流動(dòng)性，應(yīng)用Western Blotting方法檢測抗原激發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)Syk、Erk蛋白磷酸化的水平，探討糖皮質(zhì)激素對肥大細(xì)胞脫顆粒作用的可能機(jī)制。
　　 4、糖皮質(zhì)激素衍生物對抗原刺激肥大細(xì)胞脫顆粒過程中肥大細(xì)胞胞內(nèi)cAMP水平的影響：應(yīng)用放射免疫測定法檢測了糖皮質(zhì)激素衍生物對肥大

8、細(xì)胞中cAMP水平的影響。
　　 5、糖皮質(zhì)激素及其衍生物對肥大細(xì)胞核內(nèi)GRE基因的激活測定：肥大細(xì)胞轉(zhuǎn)染了MMTV-luc之后，應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測糖皮質(zhì)激素及其衍生物孵育不同時(shí)間之后對核內(nèi)GRE基因的激活情況。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1、合成了疏水性糖皮質(zhì)激素衍生物氫化可的松-21-苯丙氨酸酯鹽酸鹽(HP)，采用核磁共振氫譜和質(zhì)譜方法鑒定，結(jié)果表明合成的糖皮質(zhì)激素衍生物結(jié)構(gòu)及分子式正確

9、。
　　 2、在體外抗原激發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒模型上，氫化可的松-21-甘氨酸酯鹽酸鹽(HG)預(yù)孵育可以劑量依賴性的快速抑制抗原激發(fā)的肥大細(xì)胞組胺釋放，且作用與傳統(tǒng)糖皮質(zhì)激素?zé)o差異，并且這種作用不能被糖皮質(zhì)激素經(jīng)典胞內(nèi)受體拮抗劑(RU38486)和蛋白合成抑制劑(放線菌酮)阻斷，結(jié)果表明該作用中非基因組機(jī)制的存在；同時(shí)，糖皮質(zhì)激素衍生物對組胺釋放的抑制作用還具有明顯的時(shí)間特征。
　　 3、糖皮質(zhì)激素可以劑量依賴性的快速升高肥

10、大細(xì)胞的細(xì)胞膜微黏度，降低膜流動(dòng)性，并且這種作用不能被RU38486阻斷，結(jié)果提示有類似經(jīng)典糖皮質(zhì)激素受體樣結(jié)構(gòu)在糖皮質(zhì)激素快速影響肥大細(xì)胞膜流動(dòng)性的中發(fā)揮作用
　　 4、糖皮質(zhì)激素及其衍生物可以快速抑制抗原激發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)Syk的磷酸化，且不能被RU38486和放線菌酮阻斷。Syk特異性拮抗劑Piceatannol和糖皮質(zhì)激素均能快速抑制抗原激發(fā)的組胺釋放，提示胞內(nèi)Syk(蛋白酪氨酸激酶磷酸化)是糖皮質(zhì)激素快速抑制肥大細(xì)胞

11、脫顆粒非基因組信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵步驟。糖皮質(zhì)激素及其衍生物可以快速抑制抗原激發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒時(shí)ERK的磷酸化，且不能被RU38486阻斷，提示ERK蛋白可能是糖皮質(zhì)激素基因組機(jī)制與非基因組機(jī)制交互作用的關(guān)鍵蛋白之一。
　　 5、糖皮質(zhì)激素衍生物對抗原刺激肥大細(xì)胞脫顆粒過程中肥大細(xì)胞胞內(nèi)cAMP水平無影響，說明糖皮質(zhì)激素衍生物快速抑制肥大細(xì)胞脫顆粒不涉及G蛋白偶聯(lián)受體這條途徑。
　　 6、傳統(tǒng)糖皮質(zhì)激素氫化可的松預(yù)孵育不

12、同時(shí)間可以在15min之后檢測到GRE活性，而糖皮質(zhì)激素衍生物預(yù)孵育30min之內(nèi)均不能檢測到其活性，說明糖皮質(zhì)激素衍生物不能在短時(shí)間內(nèi)激活核內(nèi)GRE基因，其快速作用不涉及到基因組機(jī)制。
　　 雖然GC作為免疫抑制劑、抗過敏和抗炎藥物廣泛應(yīng)用于臨床，但長期使用易引起嚴(yán)重并發(fā)癥。如2002年爆發(fā)流行的SARS疫情中，大部分患者使用了不同劑量及療程的GC制劑。盡管GC在SARS治療中確實(shí)起到了緩解病情的作用，然而其使用后出現(xiàn)的諸多不

13、良反應(yīng)，包括早期的血糖增高、低血鉀、低血鈣、高血壓，后期腎上腺皮質(zhì)功能功能紊亂，嚴(yán)重繼發(fā)感染，骨壞死等。對糖皮質(zhì)激素非基因組作用機(jī)制的闡述，可以指導(dǎo)我們合成親水性的糖皮質(zhì)激素衍生物，使其不進(jìn)入胞內(nèi)與經(jīng)典的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合從而減小通過傳統(tǒng)基因組機(jī)制引起的副作用，而仍然可以通過非基因組機(jī)制起效發(fā)揮臨床效應(yīng)。
　　 本課題對糖皮質(zhì)激素快速抑制肥大細(xì)胞脫顆粒提供一個(gè)新的分子機(jī)制，即通過快速非基因組機(jī)制降低膜流動(dòng)性，快速影響抗原激發(fā)肥大