基于內(nèi)皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化的心肌纖維化細胞模型的建立和瓜蔞薤白白酒湯的應用.pdf

1、目的:基于心肌纖維化過程的內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)，以冠狀動脈內(nèi)皮細胞為基礎(chǔ)細胞，建立一種新的心肌纖維化細胞模型;并在此模型基礎(chǔ)上，開展該模型的應用研究，觀察瓜蔞薤白白酒湯(GXD)對心肌纖維化的影響，明確瓜蔞薤白白酒湯對心肌纖維化的作用機理及作用靶點，為瓜蔞薤白白酒湯臨床用于心肌纖維化的治療提供實驗支持。
　　方法:實驗分為4個部分。
　　1.基于EndMT心肌纖維化細胞模型的構(gòu)建:以人冠狀動脈內(nèi)皮細胞(HCAEC)為

2、基礎(chǔ)細胞，rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3為候選誘導劑，以內(nèi)皮細胞標志性蛋白CD31和間質(zhì)細胞特異性蛋白FSP1/α-SMA為檢測指標，從作用時間、劑量、作用強度篩選出合適的誘導劑，并通過檢測心肌纖維化相關(guān)指標Ⅰ、Ⅲ型膠原含量、MMP-1、MMP-9進行模型的鑒定。
　　2.心肌纖維化細胞模型的應用—瓜萎薤白白酒湯對心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響:由于現(xiàn)在臨床上沒有良好的治療心肌纖維化的藥物，所以本課題選擇具有一定研

3、究基礎(chǔ)的治療“胸痹”的傳統(tǒng)中藥復方——瓜蔞薤白白酒湯為新構(gòu)建的心肌纖維化細胞模型的應用藥物。利用新構(gòu)建的心肌纖維化細胞模型，以冠狀動脈內(nèi)皮細胞為基礎(chǔ)細胞，加入誘導劑，復制心肌纖維化細胞模型，檢測CD31、FSP1和α-SMA，從細胞水平觀察瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位對心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響;復制細胞模型，檢測TGFβ通路Smad1、Smad2及其上游Notch通路Notch受體North1和Notch配體Jagged1、Jagge

4、d2、DLL1、DLL2、DLL3，從分子水平觀察瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位對心肌纖維化內(nèi)皮——間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。
　　3.瓜萎薤白白酒湯抑制心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的整體驗證:在整體實驗上瓜蔞薤白白酒湯是否也能抑制心肌纖維化的EndMT呢，如果體外——體內(nèi)結(jié)果實現(xiàn)了一致性，說明應用我們構(gòu)建的細胞模型得到的研究結(jié)果是可靠、可信的。采用結(jié)扎動物左冠狀動脈前降支復制大鼠心肌纖維化模型，觀察瓜蔞薤白白酒湯對模型動物心臟指數(shù)、血流動力學、超聲

5、心動圖參數(shù)、心肌酶譜、Ⅰ、Ⅲ型膠原含量、心肌組織病理學檢查、Masson染色檢查心肌組織膠原容積分數(shù)(CVF)的影響;通過新構(gòu)建的心肌纖維化細胞模型，我們發(fā)現(xiàn)瓜蔞薤白白酒湯通過Notch通路抑制TGF-β通路而實現(xiàn)保護內(nèi)皮細胞，阻斷EndMT，抑制心肌纖維化。通過組織免疫組化、免疫熒光和Westernblot檢測整體實驗動物心肌纖維化組織TGF-β1、CD31、FSP1和α-SMA，以觀察瓜蔞薤白白酒湯對心肌纖維化整體動物內(nèi)皮——間質(zhì)轉(zhuǎn)

6、化的影響，判斷體外——體內(nèi)實驗結(jié)果是否具有一致性。
　　結(jié)果:
　　1.基于EndMT心肌纖維化細胞模型的構(gòu)建:在研究劑量范圍100ng/mL～0.01 ng/mL考察rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞活性的影響發(fā)現(xiàn)，rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3對HCAEC有著相同的作用，在加入細胞后48h(2d)，對細胞活力產(chǎn)生一定的抑制作用(P＜0.05～0.01)，在研究劑量范圍內(nèi)，對

7、HCAEC的抑制作用沒有劑量梯度性，只是有與無的差別。細胞免疫熒光測定發(fā)現(xiàn):HCAEC經(jīng)rhTGFβ1誘導7d，CD31、FSP1陽性表達率分別為43.38％、56.60％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ2誘導7d，CD31、FSP1陽性表達率分別為42.62％、56.20％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ3誘導7d，CD31、FSP1陽性表達率分別為46.00％、55.32％，rhTGFβ各組間比較沒有顯著性差異;流式檢測發(fā)現(xiàn):HCAEC經(jīng)rhT

8、GFβ1誘導7d，CD31、α-SMA陽性表達率分別為38.43％、49.13％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ2誘導7d，CD31、α-SMA陽性表達率分別為37.37％、48.07％，HCAEC經(jīng)rhTGFβ3誘導7d，CD31、α-SMA陽性表達率分別為37.9％、50.50％，rhTGFβ各組間比較沒有顯著性差異;collagenⅠ檢測發(fā)現(xiàn):經(jīng)rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ310ng/mL誘導7d后，培養(yǎng)液上清中coll

9、agenⅠ濃度分別達到了1.29、1.35、1.32μg/mL，rhTGFβ各組間比較沒有顯著性差異?？梢?，在體外，rhTGFβ1、rhTGFβ2、rhTGFβ3有著相同的作用，均能誘導HCAEC發(fā)生表型的改變，從動脈內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，且誘導效果相近，但在組織環(huán)境中TGFβ1的含量明顯高于TGFβ2、TGFβ3，且TGFβ1介導了胚胎時期心臟發(fā)育過程中的EndMT，所以本課題決定選取rhTGFβ1為心肌纖維化細胞模型構(gòu)建中的誘導劑

10、。在確定了誘導劑后，流式細胞分析術(shù)發(fā)現(xiàn)，隨著誘導時間的延長，內(nèi)皮細胞的標志CD31的表達逐漸減少，間質(zhì)細胞的標志α-SMA的表達逐漸增加，但誘導效率并不隨著劑量的增加而增加，劑量100ng/mL與10ng/mL有著相同的誘導效率，1 ng/mL和0.1 ng/mL的誘導效率低于10ng/mL，即誘導效率100 ng/mL=10ng/mL＞1ng/mL＞0.1 ng/mL，所以誘導劑的最佳劑量為終濃度10ng/mL;以10ng/mL的rh

11、TGFβ1在不同時間點誘導的α-SMA+間質(zhì)細胞擬合曲線，計算出經(jīng)rhTGFβ110ng/mL誘導7天為最佳作用時間。HCAEC經(jīng)rhTGFβ1誘導7d，心肌纖維化各項指標collagenⅠ、MMP-1/MMP-9表達明顯增加。利用內(nèi)皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化構(gòu)建心肌纖維化細胞模型的誘導劑為rhTGFβ1，作用劑量為10ng/mL，作用時間為7天，可成功構(gòu)建該細胞模型。
　　2.心肌纖維化細胞模型的應用—瓜萎薤白白酒湯對心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)

12、轉(zhuǎn)化的影響:流式法和Westernblot法檢測內(nèi)皮細胞特異性標志CD31和間質(zhì)細胞特異性標志FSP/α-SMA發(fā)現(xiàn):HCAEC經(jīng)rhTGFβ1誘導7天，可成功復制心肌纖維化模型，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位可明顯抑制內(nèi)皮細胞的減少，使細胞保持內(nèi)皮特性，并抑制其向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，與模型組比較，P＜0.05～0.01，從而達到對EndMT的調(diào)控作用;通過新構(gòu)建的心肌纖維化細胞模型，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位可明顯下調(diào)TGF-β通路的Smad1、S

13、mad2和Notch通路的North1、Jagged1、、Jagged2、DLL1、DLL2表達(P＜0.05～0.01)，而達到抑制EndMT。說明瓜萎薤白白酒湯通過Notch通路抑制TGF-β通路而實現(xiàn)保護內(nèi)皮細胞，阻斷EndMT，抑制心肌纖纖維化。
　　3.瓜萎薤白白酒湯抑制心肌纖維化內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的整體驗證:利用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支復制心肌纖維化動物模型，給予瓜蔞薤白白酒湯正丁醇部位三個劑量(6、12、24g生藥/kg

14、)，連續(xù)4周。超聲心動圖顯示，與模型組比較，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇組部位可明顯降低LVID、LVEDV、LVESV和升高IVS、LVPW、EF、FS(P＜0.05～0.01);還可改善模型大鼠的血流動力學水平，高劑量組可顯著增加LVSP、±dp/dtmax、HR、SAP和DAP，同時中、高劑量可減少LVEDP，與模型組比較P＜0.05～0.01;顯著抑制心肌酶譜AST、LDH和CK-MB的增加，與模型組比較P＜0.05;與模型組相比，瓜蔞

15、薤白白酒湯高劑量組可見LVM、HM、LVMI、HMI的顯著降低(P＜0.05～0.01);心臟組織病理學檢查顯示，瓜蔞薤白白酒湯正丁醇組肌纖維排列較有序、整齊，心肌細胞輕度肥大，間質(zhì)可見少量炎細胞浸潤，間質(zhì)纖維組織輕度增生，染色相對均勻，Masson染色法顯示瓜蔞薤白白酒湯正丁醇中、高劑量組心肌細胞數(shù)目明顯增多，排列規(guī)則有序，心肌組織藍色膠原染色部分較模型組有所減少;瓜蔞薤白白酒湯正丁醇中、高劑量組的CVF值和羥脯氨酸含量較模型組明顯降

16、低;瓜蔞薤白白酒湯正丁醇組大鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達量較模型組心肌組織中的表達量顯著降低(P＜0.05～0.01)?？梢?，瓜蔞薤白白酒正丁醇部位對心肌纖維化大鼠有明顯的保護作用，這為以后開展將瓜蔞薤白白酒湯應用于本課題新構(gòu)建的心肌纖維化細胞模型的應用確立了前期實驗基礎(chǔ)。整體實驗發(fā)現(xiàn)，瓜蔞薤白白酒湯可顯著降低TGF-β1的表達，抑制心肌纖維化所致CD31表達的減少和α-SMA/FSP1表達的增加(P＜0.05～0.01)，這一

17、結(jié)果與體外實驗是一致的，瓜蔞薤白白酒湯通過抑制EndMT實現(xiàn)抗心肌纖維化作用。說明通過新構(gòu)建的心肌纖維化細胞模型所得的研究數(shù)據(jù)是真實、可靠、可信的。
　　結(jié)論:構(gòu)建基于內(nèi)皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的心肌纖維化細胞模型的方法為:以人冠狀動脈內(nèi)皮細胞為基礎(chǔ)細胞，rhTGFβ1為誘導劑，在終濃度為10ng/mL的誘導劑作用7天時，動脈內(nèi)皮細胞可轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞，表達間質(zhì)細胞特異性標志，并高表達心肌纖維化相關(guān)指標。將該方法成功應用于瓜蔞薤白白酒湯對心