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文檔簡介
1、內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化(atheriosclerosis,As)血管并發(fā)癥的始動(dòng)環(huán)節(jié)。內(nèi)皮功能障礙與大血管病變的發(fā)生、高血壓和心力衰竭等心血管疾病有密切關(guān)系,其中磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)作為一種重要的蛋白激酶參與多種代謝過程,被稱為是“細(xì)胞能量調(diào)節(jié)器”,能感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變,并通過影響細(xì)胞物質(zhì)代謝的多個(gè)環(huán)節(jié)維持細(xì)胞能量供求平衡,在細(xì)胞內(nèi)行使能量代
2、謝調(diào)節(jié),從而對內(nèi)皮功能有重要作用。AMPK活性受AMP/ATP比值調(diào)控,被稱為細(xì)胞的“代謝感受器”或調(diào)控細(xì)胞ATP和AMP水平的“燃料開關(guān)”。AMPK的長期作用可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,短期作用可以調(diào)節(jié)各種能量代謝,如增加葡萄糖攝取和糖酵解,刺激脂肪酸氧化。當(dāng)體內(nèi)能量缺乏時(shí),通過AMP/ATP比值調(diào)節(jié)AMPK的活性。例如在缺氧、低氧和氧化磷酸化受抑制時(shí),肌酸/磷酸肌酸比值與AMP/ATP比值升高,AMPK可以被磷酸化和激活。當(dāng)機(jī)體受到
3、應(yīng)激或者病理刺激時(shí),AMPK可以影響脂肪酸、糖原與蛋白質(zhì)的代謝過程,對心血管系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)具有重要作用。在心肌及血管平滑肌,缺血、缺氧或心血管活性物質(zhì)刺激時(shí),AMPK的激活還可以通過影響細(xì)胞周期以及物質(zhì)代謝,從而抑制細(xì)胞增殖。因此,AMPK在動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防與治療過程中具有重要作用。
二甲雙胍(Metformin,Met)是歐洲糖尿病研究協(xié)會(huì)(EASD)和美國糖尿病聯(lián)合會(huì)(ADA)共同推薦的2型糖尿病一線用藥被用來治療糖尿
4、病已經(jīng)有50余年,其除了具有降糖作用外,還有獨(dú)立于降糖作用以外的血管保護(hù)作用,能夠降低心死亡率和改善慢性心力衰竭的預(yù)后[1,2],是目前為止唯一一個(gè)擁有比較堅(jiān)實(shí)的心血管保護(hù)作用循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的降糖藥物。因?yàn)閱我皇褂枚纂p胍可以保持體重和減少心血管事件,所以說是肥胖患者與2型糖尿病的首選藥物。最近有臨床研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍不僅能改善糖化血紅蛋白(HbAlc)和減少2型糖尿病心血管并發(fā)癥和心力衰竭的預(yù)后,還可以通過激活A(yù)MPK對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生保
5、護(hù)作用。但其心血管保護(hù)作用的具體分子機(jī)制目前尚不完全明確。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用二甲雙胍及AMPK激活劑AICAR作用于經(jīng)軟脂酸(Palmiticacid,PA)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC),檢測二甲雙胍干預(yù)前后HUCEC細(xì)胞磷酸化AMPK、eNOS的蛋白表達(dá)水平,以及培養(yǎng)液中NO、eNOS含量,研究二甲雙胍及AMPK的
6、激活劑AICAR對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞AMPK磷酸化水平、NO和eNOS含量的影響,探討二甲雙胍激活A(yù)MPK改善血管內(nèi)皮及損傷的內(nèi)皮功能的可能分子機(jī)制,也為有效防治糖尿病患者的心血管并發(fā)癥提供新的途徑和靶點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)方法:
1.常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,并分為六組:①空白對照組(常規(guī)培養(yǎng))、②二甲雙胍(Metformin, Met)2mmol/1組、③軟脂酸(Palmitic acid, PA)300μmol/1組
7、、④軟脂酸300μmol/1+二甲雙胍2mmol/1組、⑤5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸(5-Aminoimidazole-4carboxamide-ribo-nucle-oside,AICAR)1mmol/1組、⑥軟脂酸300μmol/1+AICAR1mmol/1組,經(jīng)孵育24h后,收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。
2.采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HUVEC細(xì)胞表達(dá)P-AMPK和eNOS。
3.采用硝酸鹽還原法檢測各組
8、培養(yǎng)上清液中NO的含量。
4.采用ELISA法測定eNOS含量。
5.采用Western Blot方法檢測各組細(xì)胞的P-AMPK、eNOS蛋白的表達(dá)。
6.采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料用x±s表示,多組資料間的比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD的方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
1.一氧化氮生成量:與空白對照組(164.29±33.71μ
9、mol/L)相比,軟脂酸組(76.85±18.02μmol/L)的培養(yǎng)液中一氧化氮生成減少;與軟脂酸組相比,AICAR+PA組(159.13±38.53μmol/L)、Met+PA組(115.19±57.55μmol/L)的培養(yǎng)液中一氧化氮生成增加:與空白對照組相比,AICAR組(312.57±20.61μmol/L)、Met組(263.57±46.11μmol/L)的培養(yǎng)液中一氧化氮生成增加,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
10、> 2.一氧化氮合成酶生成量:與空白對照組(71.98±26.61μmol/L)相比,軟脂酸組(46.57±27.42μmol/L)的培養(yǎng)液中內(nèi)皮型一氧化氮合酶生成減少;與軟脂酸組相比,AICAR+PA組(92.28±51.01μmol/L)、Met+PA組(69.11±14.96μmol/L)的培養(yǎng)液中內(nèi)皮型一氧化氮合酶生成增加;與空白對照組相比,AICAR組(139.47±27,29μmol/L)、Met組(134.09±34
11、.61μmol/L)的培養(yǎng)液中內(nèi)皮型一氧化氮合酶生成增加,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
3.P-AMPK蛋白表達(dá)量:與空白對照組相比,軟脂酸組的P-AMPK蛋白表達(dá)量低下;與軟脂酸組相比,AICAR+PA組、Met+PA組的P-AMPK蛋白表達(dá)量增加:與空白對照組相比,AICAR組、Met組的P-AMPK蛋白表達(dá)量增加,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
4.eNOS蛋白表達(dá)量:與空白對照組相比,軟
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