抵抗素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠肥厚心肌腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響.pdf

1、背景和立題依據(jù)：
　　心肌肥厚是導(dǎo)致心力衰竭、心律失常和猝死主要原因之一。本課題針對(duì)心肌肥厚的產(chǎn)生機(jī)制:抵抗素/脂聯(lián)素/AMPK這一通路對(duì)心肌肥厚的影響提出。本課題對(duì)尋找新的治療心肌肥厚及心衰的靶點(diǎn)有重要意義。實(shí)驗(yàn)由體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)完成，是在前人研究抵抗素、脂聯(lián)素與心肌肥厚相關(guān)，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)可抑制心肌肥厚基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入探討，通過(guò)注射載有抵抗素基因重組腺病毒注射液造模，并觀察抵抗素對(duì)其血壓收縮壓(SBP)和脂聯(lián)

2、素(AN)及其下游蛋白酶AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子的影響。闡明抵抗素/脂聯(lián)素/AMPK在心肌肥厚形成中的重要作用，為心肌肥厚的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　目的：
　　探討抵抗素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)肥厚心肌腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子改變的影響。注射載有抵抗素基因重組腺病毒注射液大鼠造模，并觀察抵抗素對(duì)其血壓收縮壓(SBP)和脂聯(lián)素(AN)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子的影響。
　　材

3、料與方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)藥品及主要試劑
　　大鼠脂聯(lián)素ELISA檢測(cè)試劑盒，美國(guó)ADL公司。載有抵抗素基因重組腺病毒注射液1×1010PFU，3ml，上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司?？沽姿峄疉MPK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，非磷酸化AMPK抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，Trizo1試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，O ligo-dT、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑及Ta

4、q酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司，其他試劑均為分析純產(chǎn)品。
　　2.方法
　　2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　8周齡Wistar大鼠及SHR大鼠，雄性，體重180-200 g，分別購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)分別為SCXK(粵)2013-0001和SCXK(京)2013-0002。以8周齡Wistar大鼠作為正常對(duì)照，將同周齡SHR大鼠按體重隨機(jī)分為4組，即SHR組，高劑量組（載有抵抗素

5、基因重組腺病毒注射液，劑量:1×109PFU/只），中劑量組（載有抵抗素基因重組腺病毒注射液，劑量:0.5×109PFU/只），低劑量組（載有抵抗素基因重組腺病毒注射液，劑量:0.25×109PFU/只）。
　　2.2 ELISA檢測(cè)血清脂聯(lián)素水平
　　經(jīng)腹主動(dòng)脈取血至離心管中，室溫靜置1h，3000 r/min離心10min后吸取血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清脂聯(lián)素水平。
　　2.3 RT-PCR檢測(cè)心肌AdipoR1

6、的表達(dá)
　　采用Trizo1試劑盒提取心肌組織RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度。取RNA5ug逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)。根據(jù)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，引物序列見(jiàn)表1。PCR的擴(kuò)增條件是:94℃預(yù)變性5 min，94℃45 s-57℃45 s-72℃60 s，30個(gè)循環(huán)后72℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描系統(tǒng)（DF-23B）英國(guó)UVP公司產(chǎn)品H

7、Z-25。采用550IW圖像分析系統(tǒng)(LEICA公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行光密度掃描和分析，分別計(jì)算各指標(biāo)的光密度比值。
　　2.4 Western blot檢測(cè)
　　心肌AMPK的蛋白表達(dá)50 mg心肌組織研磨后放入20倍體積的裂解緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH7.4,150mmol/LNacl,40mmol/L NaF,5mmol/LEDTA，5mmol/L EGTA，2.175mmol/L正釩酸鈉，1％

8、TritonⅩ-100，0.1％脫氧膽酸鈉，0.1％ SDS，0.1％抑蛋白酶肽，1 mmol/L PMSF)中1000×g離心10min，收集上清，Lowry法測(cè)定蛋白濃度。配制SDS聚丙烯酰胺凝膠(4％濃縮膠，9％分離膠)，蛋白上樣量為50ug，電泳(濃縮膠80V，分離膠150V)結(jié)束后，取出凝膠，將蛋白電轉(zhuǎn)(200mA恒流冰浴轉(zhuǎn)2h)至聚偏二氟乙烯膜(po lyvinylidene difuo ride，PVDF)上。PVDF膜用

9、5％脫脂奶粉室溫封閉2h，含0.05％ Tween20的PBS(PBST)沖洗后，用抗磷酸化AMPK（1∶1000稀釋）進(jìn)行孵育，4℃過(guò)夜。經(jīng)PBST沖洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2h。PB ST沖洗，用化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光，在暗盒中膠片上曝光1～5 m in，顯影、定影后觀察結(jié)果。PVDF膜經(jīng)洗膜液洗脫30min后加抗AM PK(1∶1000稀釋)孵育，其余操作同上。采用550IW圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行光密度掃描和分析。

10、　　2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，多組組間比較采用方差分析，方差不齊采用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用計(jì)數(shù)（百分率）表達(dá)，率的比較采用x2檢驗(yàn)。全部資料用采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：
　　與Wistar大鼠比較，SHR大鼠血壓收縮壓、心肌肥大指數(shù)均顯著升高(P＜0.05)，血清脂聯(lián)素(AN)、心肌組織AdipoR1、AMPK含量降低(P＜0.05