馬鹿(Cervus elaphus)鹿茸快速生長(zhǎng)期生長(zhǎng)點(diǎn)軟骨和茸皮組織microRNA表達(dá)譜研究.pdf

1、鹿茸是哺乳動(dòng)物中唯一可以周期性表形態(tài)再生的哺乳動(dòng)物器官，是研究再生醫(yī)學(xué)分子機(jī)制和調(diào)控模式的良好動(dòng)物模型。鹿茸是公鹿額部生長(zhǎng)的尚未骨化的嫩角，外面被有茸毛，內(nèi)部是遍布神經(jīng)和血管的結(jié)締組織和軟骨組織。鹿茸每年周期性地生長(zhǎng)、脫落、完全再生，具有明顯的季節(jié)性。晚春和夏季是鹿茸的快速生長(zhǎng)期，可達(dá)到2cm/d。鹿茸軟骨和茸皮組織相互促進(jìn)共同完成鹿茸的再生，但是生長(zhǎng)期鹿茸軟骨和茸皮相輔相成快速生長(zhǎng)的分子機(jī)制尚不清楚。microRNAs(miRNAs)

2、是一類長(zhǎng)約22nt、內(nèi)源性的、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非編碼的單鏈small RNA分子，主要在轉(zhuǎn)錄后負(fù)調(diào)控基因表達(dá)，通過(guò)與靶基因mRNAs3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)的堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)降解mRNAs或者抑制mRNAs翻譯，從而發(fā)揮沉默特定靶基因的作用。已證實(shí)miRNAs廣泛參與調(diào)節(jié)動(dòng)物、植物和病毒生命過(guò)程，其功能幾乎涉及生命活動(dòng)的各個(gè)方面。然而關(guān)于miRNAs調(diào)控鹿茸再生的研究報(bào)道極少。我們由此提出如下問(wèn)題:鹿茸組織中是否有miRNAs

3、的表達(dá)？miRNAs在鹿茸不同組織中的表達(dá)量如何？研究這些問(wèn)題可以進(jìn)一步回答miRNAs與已知的鹿茸再生相關(guān)基因之間存在怎樣的相互作用關(guān)系？miRNAs是否在鹿茸再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用？
　　本研究采集了東北馬鹿生長(zhǎng)60天時(shí)的鹿茸，分離鹿茸軟骨和茸皮組織，進(jìn)行鹿茸軟骨和茸皮small RNA文庫(kù)Solexa深度測(cè)序，然后用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行深入挖掘。本文主要研究包括:(1)進(jìn)行鹿茸軟骨和茸皮small RNA高通量測(cè)序，

4、為miRNAs分析提供數(shù)據(jù);(2)分析鹿茸軟骨和茸皮miRNAs，鑒定鹿茸保守和新型miRNAs;(3)分析鹿茸軟骨和茸皮miRNAs差異表達(dá)情況;(4)預(yù)測(cè)鹿茸miRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)和靶基因，并進(jìn)行靶基因功能注釋，探討miRNAs可能行使的生物學(xué)功能;(5) q-PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。
　　主要結(jié)果如下:
　　1、鹿茸軟骨和茸皮small RNA文庫(kù)進(jìn)行miRNA Solexa測(cè)序后，分別獲得13，513，502和5，524，

5、073條原始序列讀數(shù)(raw reads)。經(jīng)過(guò)各種質(zhì)量控制程序處理后，得到9，520，645和3，621，894條高質(zhì)量可比對(duì)序列讀數(shù)(mappable reads)，分別鑒定了389和295個(gè)miRNAs。
　　2、miRNAs的序列長(zhǎng)度主要分布在18～25nt，其中鹿茸軟骨組織中序列讀數(shù)在18nt處達(dá)到峰值，茸皮組織中序列讀數(shù)在22nt處達(dá)到峰值，在鹿茸軟骨和茸皮文庫(kù)中分別占到31.5％、18.0％，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果富含潛在mi

6、RNAs。
　　3、篩選出7種類型的684個(gè)鹿茸miRNAs，其中611個(gè)為哺乳動(dòng)物保守miRNAs，73個(gè)為鹿茸新的候選miRNAs。
　　4、結(jié)果顯示，所得單一miRNAs中有大量異構(gòu)體isomiRNAs存在。其中293個(gè)保守miRNAs的末端堿基發(fā)生變化，堿基增加的數(shù)目大于減少的數(shù)目，且miRNAs3'端的堿基變化數(shù)目大于5'端;94個(gè)miRNAs發(fā)生堿基替換，包括62個(gè)轉(zhuǎn)換和32個(gè)顛換。
　　5、鹿茸軟骨和茸皮

7、文庫(kù)miRNAs的表達(dá)主要集中在表達(dá)量前20位的miRNAs上（均占所有miRNAs總拷貝數(shù)的80％以上），其中miR-21在鹿茸軟骨中拷貝數(shù)最高，miR-127在鹿茸茸皮中拷貝數(shù)最高。兩個(gè)組織間共有168個(gè)miRNAs表達(dá)存在差異，103個(gè)miRNAs表達(dá)差異顯著。
　　6、首次通過(guò)同源比對(duì)構(gòu)建了馬鹿鹿茸的miRNAs表達(dá)譜。將鹿茸611個(gè)保守miRNAs與miRBase(v18.0)數(shù)據(jù)庫(kù)中已注釋的miRNAs序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)

8、果顯示鹿茸和牛的保守miRNAs數(shù)目最多，達(dá)422個(gè)，其次為野豬(42)、小鼠(37)、綿羊(35)和人(27)。
　　7、用mfold軟件預(yù)測(cè)了鹿茸miRNAs前體二級(jí)結(jié)構(gòu)，均可形成典型的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此外，利用TargetScan軟件預(yù)測(cè)了鹿茸軟骨和茸皮文庫(kù)中保守和新發(fā)現(xiàn)的miRNAs（共39個(gè)）的靶基因，其功能有待進(jìn)一步研究。
　　8、通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)技術(shù)驗(yàn)證了鹿茸軟骨和茸皮組織中拷貝數(shù)差異顯著或不顯

9、著的14條保守miRNAs在兩個(gè)文庫(kù)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，q-PCR的數(shù)據(jù)與測(cè)序數(shù)據(jù)基本一致。本次測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠，能夠反映鹿茸軟骨和茸皮miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)。
　　本研究從miRNA調(diào)控鹿茸生長(zhǎng)發(fā)育的角度出發(fā)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得快速生長(zhǎng)期鹿茸軟骨和茸皮組織的miRNAs表達(dá)譜，分析其序列特征，檢測(cè)miRNAs在鹿茸快速生長(zhǎng)期不同組織中的表達(dá)水平，篩選與鹿茸再生相關(guān)的miRNAs。馬鹿鹿茸軟骨和茸皮miRNAs的鑒定與功能