小劑量內(nèi)毒素對腸道上皮細胞天然屏障功能及TLR2,4表達的影響.pdf

1、目的:
　　以致病性大腸桿菌和雙歧桿菌來源的內(nèi)毒素作用于大鼠腸道正常上皮細胞IEC18后,觀察不同細菌來源的內(nèi)毒素對上皮細胞Toll樣受體2和4表達的影響,以及跨膜細胞電阻的改變,探討致病菌和雙歧桿菌這兩類不同腸道共生菌來源的小劑量內(nèi)毒素誘導(dǎo)腸上皮細胞發(fā)揮免疫防御功能的機制。
　　方法:
　　將致病性大腸桿菌內(nèi)毒素O127:B8加入細胞中,分別是0.5mg/ml,1mg/ml,5mg/ml3種不同濃度。幼兒雙歧桿菌、長

2、雙歧桿菌、兩雙歧桿菌、青春雙歧桿菌上清液分別稀釋100倍,300倍加入細胞中。在干預(yù)4小時,8小時,12小時,16小時后采用熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測上皮細胞干預(yù)后TLR2,4mRNA表達情況,找出最佳干預(yù)濃度及時間點后,實驗分為六組:空白對照組、EPEC(O127:B8)組、幼兒雙歧桿菌組、長雙歧桿菌組、兩雙歧桿菌組、青春雙歧桿菌組。Westernblot檢測各實驗組IEC18后細胞的TLR2,4蛋白的表達改變。

3、上皮細胞跨膜電阻儀(EVOM)測量六組細胞在30分鐘,60分鐘,90分鐘,120分鐘的跨膜細胞電阻的改變。
　　結(jié)果:
　　根據(jù)qRT-PCR檢查的不同干預(yù)條件下IEC18細胞的最佳時間為干預(yù)16小時,EPEC內(nèi)毒素濃度為5mg/ml,四種雙歧桿菌稀釋300倍為有效濃度。在干預(yù)16小時后,EPEC組與對照組相比TLR2mRNA和TLR4mRNA的表達增加了7.46±1.227和13.77±1.27倍(P值均<0.001)。幼

4、兒雙歧桿菌組、長雙歧桿菌組和青春雙歧桿菌組的IEC18細胞與空白組相比TLR2mRNA的表達降低,有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。幼兒雙歧桿菌組0.39±0.12、長雙歧桿菌組0.47±0.43和青春雙歧桿菌組0.47±0.25,這三組雙歧桿菌組間TLR2mRNA的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩雙歧桿菌組(0.55±0.27)TLR2mRNA的表達降低無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩雙歧桿菌組(0.41±0.34)和青春雙歧

5、桿菌組(0.46±0.37)與空白對照組相比TLR4mRNA的表達降低(P值均<0.05)。而幼兒雙歧桿菌(0.66±0.20)和長雙歧桿菌(0.59±0.11)TLR4mRNA的表達降低無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。這四種雙歧桿菌組間TLR4mRNA的表達無統(tǒng)計學(xué)差異(P值均>0.05)。上述各實驗組TLR2,4mRNA表達趨勢的改變與westernblot檢測各實驗組干預(yù)后TLR2,4蛋白表達的改變一致。IEC18的跨膜細胞電阻

6、值下降。幼兒雙歧桿菌組、長雙歧桿菌組、兩雙歧桿菌組、青春雙歧桿菌組跨膜細胞電阻值分別下降了19％,18%,23%,23%。與空白組及四組雙歧桿菌組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。EPEC組跨膜細胞電阻下降了67%,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　腸道上皮細胞是腸道粘膜免疫系統(tǒng)重要組成部分,正常腸道上皮細胞表達少量的TLR2和TLR4,防止有害病菌的入侵以及維持腸道眾多共生菌穩(wěn)定中起到重要作用。小劑量的致病性大